第三章 遗传的分子基础

（三）复制的不连续性
新链的延伸方向只能是5’－3’ （沿模板3’－5’ ），因此： 一条链一直从5’向3’方向延 伸，称前导链，连续合成； 另一条先沿5’ 3’ 合成冈崎 片段，再由连接酶连起来， 称后随链，不连续合成。 因此，DNA是半不连续复制 (semidiscontinuous replication) replication
碱基
核苷酸，多核苷酸链（一级结构）
二、 DNA双螺旋模型
Watson & Crick建立双螺旋模型主要是从下面的线 索开始的： （1）大量结晶资料的积累。 1938年W.T.Astbury & Bell用x衍射技术研究 DNA。1947年拍摄了第一张DNA的x衍射照片， 并推断DNA分子的结构是： ① 柱状； ② 多核苷酸是一叠扁平的核苷酸； ③ 核酸残基取向和分子长轴垂直,间距为3.4 nm。
1、Meselson-Stahl实验 2、Taylar实验 3、姐妹染色单体差别染色方法（sisterchromatid differential staining） 4、Cairns复制模型—θ型复制
1、Meselson-Stahl的实验（1958）
该实验是DNA双螺 原理：用重同位素15N标记 旋模型的第一个证 DNA，用CsCl密度梯度 据，也是迄今为止最 离心来区分新旧两条链。 有力的证据。 15N(15NH Cl )标记E.coli 4 DNA E.coli移到 14N(14NH Cl ) 培养基 4 定期取样， CsCl密度梯度 离心分析。
二、 Hershey-Chase 的噬菌体感染实验
1952年，Hershey和Chase 进行了噬菌体感 染实验，证明噬菌体的遗传物质是DNA。
1. 背景知识
噬菌体侵染与繁殖的基本过程： • T2噬菌体侵染大肠杆菌后，遗传物质进入细菌细胞；
• 利用大肠杆菌的遗传复制系统复制噬菌体遗传物质； • 利用大肠杆菌的遗传信息表达系统合成噬菌体组件； • 最后组装形成完整的T2噬菌体。 因此只要弄清侵染时进入细菌的是噬菌体的哪一部分，就 可能证明哪种物质是遗传信息的载体。 另外：P是DNA的组成部分，但不存在于蛋白质中；S存 在于蛋白质中，但DNA中没有。
定点、双向对称复制如 E.coli染色体
双向不对称复制 如 枯草杆菌
早期为单向复制， 复制了约1/5基因 组进行时双向向复 制，如质粒R6K 。
单向复制 如质粒Col E1
真核生物染色体多起点的DNA双向复制
This allows for rapid replication.
– A human cell can copy its 6 billion base pairs and divide into daughter cells in only a few hours.
预期
结果
2、Taylor 蚕豆根尖放射自显影实验(1958)
在染色体水平上证明了DNA 的半保留复制
蚕豆幼苗在含有3H标记胸腺嘧啶核苷 的热培养基中培 养，使染色体都带有放射性； 把根移到含秋水仙素的非放射性的冷培养基； 染色体制片，放射自显影，观察第一次和第二次分裂结 果。实验结果与预期符合 果。
BrdU（5溴脱氧尿嘧啶）掺入（两次复制） Giemsa 染色 （在BrdU 中合成的DNA链着色浅，与原来的链明显不同）
3、姐妹染色单体差别染色方法
China Hamster（中国仓鼠）的色差染色体（harlequin chromosomes）
4、Cairns的放射自显影实验(1963)—θ型 复制模式的发现
2. 重组合试验（Fraenkel-Conrat，1956）
第二节 DNA的结构和性质
一、 DNA的化学组成和一级结构 二、 DNA的双螺旋结构模型(二级结构) 三、双螺旋结构的构象变异 四、DNA的变性和复性
一、DNA 的化学组成与一级结构
水解 核酸 单核苷酸 磷酸基团 戊核糖 核苷 碱基 脱氧核糖(DNA 中) 核糖 (RNA 中) T A DNA 中 G C RNA 中 U
DNA双螺旋模型的特点
(1) DNA分子由两条反向平行(一条3’ 5’,另一条 5’ 3’)的多核苷酸链组成，形成右手双螺旋。 (2) 糖-磷酸键是在双螺旋的外侧，碱基对与轴线 垂直。糖与附着在糖上的碱基近于垂直。 (3) 碱基配对时，必须一个是嘌呤，另一个是嘧 啶，即A与T配对，G与C配对。 (4)螺旋上升一圈为10 bp, 螺距为3.4 nm。 (5) DNA 双 螺 旋 有 大 沟 （ major or wide groove）和小沟（minor or narrow groove） 的存在。
（五）复制的模式
1. Θ复制：从一个复制 起点开始向两个方向 复制，形成Θ 复制 泡（中间体）。环状 DNA分子具有，如E. coli 染色体的复制。
2. σ 复制（滚环复 制）：中间体呈σ 形。环状DNA分子转 换而来的线状分子的 复制方式。如Φ X174病毒DNA，F因 子和Hfr 染色体转移 时的复制。
每个新合成的DNA分子都含 有一条热链和冷链
3H-胸腺嘧啶核苷
二、DNA 的复制特性
（一）复制起点与复制子
复制起点（Ori）：复制起始所需的特定核苷酸序 列。在E. coli 为245 nt，富含AT。 复制子（replicon）：从一个起始点开始能独立进行复 制的DNA区段。 细菌染色体、质粒和病毒：1个复制子(单复制子) 真核生物 ：一个DNA分子有几个复制子(多复制子) 10-250 um(3×10 4 ­ 8×105 bp)/replicon 。 复制由起始点进行调节，一旦复制开始，即进行到 底。
第三章 遗传的分子基础
第一节 核酸是遗传物质的证明 第二节 DNA的结构和性质 第三节 DNA的复制 第四节 遗传信息的表达
第一节 核酸是遗传物质的证明
遗传物质必须具备的特点： 1）在体细胞中含量稳定； 2）在生殖细胞中含量减半； 3）能携带遗传信息； 4）能精确地自我复制； 5）能发生变异。
一、肺炎双球菌的转化实验
脂类
RNA
蛋白质
RⅡ
RⅡ
RⅡ
RⅡ
RⅡ
RⅡ
不杀死 小鼠
不杀死 小鼠
不杀死 小鼠
不杀死 小鼠
可杀死 小鼠
不杀死 小鼠
RⅡ
RⅡ
RⅡ
RⅡ
RⅡ+SⅢ
RⅡ
O.Avery 等的体外转化实验
人们仍不相信DNA是遗传物质,这是由于：
（1）认为蛋白分子量大，结构复杂，二十种氨 基酸的排列组合将是个天文数字，可作为一种 遗传信息。而DNA分子量小，只含4种不同的 碱基，人们一度认为不同种的有机体的核酸只 有微小的差异。 （2）认为转化实验中DNA并未能提得很纯，还 附有其它物质。 （3）即使转化因子确实是DNA，但也可能DNA 只是对荚膜形成起着直接的化学效应，而不是 充当遗传信息的载体。
三、烟草花叶病毒的重建实验
烟草花叶病毒(TMV)是由RNA与蛋白质构成的 管状微粒：中心是单链螺旋RNA、外部是螺旋 排列的蛋白质外壳。
1、拆分感染试验
将TMV的RNA与蛋白质分离、提纯，分别接种烟 叶，发现： （1）RNA能使烟叶致病，而蛋白质不能； （2）用RNA酶处理RNA后接种烟叶不能致病。 表明RNA可能就是TMV的遗传物质。
（二）复制的方向
制。 枯草杆菌：有固定的起始 点，双向不对称复制。 质 粒 R6K ： 早 期 为 单 向 复 制，复制了约1/5基因组 进行 时双向复制。 质 粒 Col E1 ： 有 固 定 起 始 点，但却为单向复制。 真核生物：有多个复制起 点，双向等速复制。
复制叉
E.coli ： 定 点 、 双 向 对 称 复
实验
吸附 振荡 测放射性 离心
结果与结论
主要是由于DNA进入细胞内才产生完整的 噬菌体。
结论：DNA才是(噬菌体的)遗传物质。
题外话： 与Avery等人研究比较，本试验的精度低得 多。但是，由于放射性标记法(也称为示踪原子 法)当时为人们普遍采用，同时由于核酸研究及 其它相关的成果，本实验结果很快得到人们的广 泛认同。
A-DNA
B-DNA
Z-DNA
四、 DNA的变性与复性
（一）DNA 变性(denaturation)与复性(renaturation) 原理
1、导致DNA变性的因素： 高温 酸 碱 尿素 甲酰胺 2、DNA变性后物理性质发生的变化： （1）流体力学的性质发生改变：粘度下 降，而沉降速度增加； （2）提高了对紫外线的吸收能力，此称为 增色效应（hyperchromic effect）。
5‘
3‘
3‘ 5‘
三、 双螺旋结构的构象变异
DNA的构象主要有：A、B、Z 型。
引起DNA双链构象改变有以下因素：核苷酸顺序、碱基组 成、盐的种类、相对湿度。 B-DNA：较高湿度下存在；每圈10bp，宽的大沟和窄的小 沟；最接近生理条件下DNA的一般结构。 A-DNA：较小湿度下存在，每圈11bp，窄而深的大沟和宽 且浅的小沟；在某些DNA-蛋白质复合体中存在。以双螺旋 形式存在的RNA分子具有相似的结构。 Z-DNA：在溶液中，高阳离子浓度下（如Na+），中和了 带负电的磷酸基团，交替的嘌呤-嘧啶残基（如poly(dGdC) ）会出现左手螺旋构象。每个螺旋有12bp；大沟消 失，小沟窄而深。在低盐浓度下，它会形成典型的右手螺 旋构象。 Z-DNA的生理意义还不清楚。Z-DNA在细胞的 DNA中可能只占很小的一部分。
rep ssb gyrA,gyrB polA polC lig dnaG
双链DNA的A260=1.00（浓度为50μg/ml时，对波长260nm紫外 线的吸收能力）； 单链DNA的A260=1.37； 游离碱基或核苷酸的A260=1.60。
temperature, Tm）或熔 点，是A260的升高达到极大 值一半时的温度，即变性温 度范围的中点。 当GC的含量上升1%，则 Tm上升0.4℃ 马默多蒂（MarmurDoty）关系式： Tm = 69.3+0.41(G +C)%， 或 GC%=（Tm-69.3）×2.44
3、解链温度（melting
第三节 DNA 的复制
一、半保留复制的验证 DNA复制的可能方式：
半保留复制模型（semi-conservative model） 全保留复制模型(conservative model) 分散复制模型(dispersive model)。
DNA 的半保留复制模型
验证半保留复制的实验
3. Y型复制：真核生物 染色体DNA的复制， 有Y型中间体形成。
三、原核生物DNA复制
E. coli 复制主要的基因和酶
酶（蛋白质） 解旋酶（rep蛋白） 单链结合蛋白（SSB） 拓扑异构酶（旋转酶） DNA聚合酶I DNA聚合酶III DNA连接酶 引发酶 基因座 功能 松开双螺旋 稳定单链区 去除正超螺旋卷曲 去除RNA引物及补空缺 合成DNA新链 3‘ OH/5’ PO4切口封闭 RNA引物合成
1928年Frederick Griffith 的 转化实验
肺炎双球菌（Diplococcus pneumoniae） 致病菌株（S）：有荚膜，光滑型，致肺炎 非致病菌株（R）：无荚膜，粗糙型，不致肺炎
SⅢ 杀死细菌 分离提取
Avery 的体外转化 实验（1944）
DNA DNA+DNasewk.baidu.com
多糖
R.Franklin & Wilkins在1952年底用高度定向的 DNA纤维做出了高质量的X-光衍射照片。
（2）Chargaff的DNA “当量规律”： A=T，G=C；A+G=T+C；但A+T不一定等于 G+C。
1953年，Watson和Crick提出DNA的反向平行双 螺旋模型 ，1962年， Wilkins、 Watson和Crick 共获诺贝尔化学奖。
DNA Replication is Asymmetrical
（四）复制需要RNA 引物
在前导链上，DNA引发酶只在起始点合成一次 引物RNA，DNA聚合酶III开始DNA的合成。 在后随链上，每个冈崎片段的合成都需要先合 成一段引物RNA，然后DNA聚合酶III才能进行 DNA的合成。 引物由引发酶（primase）合成，几十个核苷 酸长，在E.coli每隔100至200nt需合成一次引 物。