浅析信号肽

由于酵母YT455在蔗糖培养基中生长依赖于sue2基因编
码的蔗糖转换酶向细胞外的分泌，所以筛选的指标是： 酵母的存活与否。
信号肽捕获系统
哺乳动物细胞筛选系统(M-SST): Tac-SST 该系统以人IL一2RoL(hTac)为报道基因构建信号肽筛选 载体。其基本原理是，将待筛选的cDNA片段与hTac(信 号肽序列已被去除)的 5’ 端相连，得到的表达载体文库 转染COS-7，然后用抗Tac抗体鉴定能够将hTac表达在 细胞膜表面的克隆，从阳性克隆中得到插入的cDNA片
蛋白表达基因
Cell
报告基因
Cell
载体基因
系统分类
信号肽捕获系统
酵母细胞筛选系统
哺乳动物细胞筛选系统
sue2- SST
筛选方法 免疫反应:Tac-SST 酶活性
使用文库 cDNA文库
细胞生死;SST-REX
基因组DNA文库
信号肽捕获系统
酵母细胞筛选系统(Y-SST):sue2- SST 用sue2作为报道基因构建粘粒载λRK18，插入胚胎 cDNA文库后转染酵母细胞YT455，用蔗糖进行筛选。
Signal peptidase Cytosol ER membrane
信号肽
1 2 3 4 研究背景
结构及作用机理
信号肽捕获系统 应用实例 展望
5
信号肽捕获系统
将报告基因和蛋白表达基因插入载体，转染细胞，如果报 告基因所表达的蛋白能得到分泌，那么此段蛋白表达基因 中含有报告基因表达所需的信号肽。
将目的基因插入pBE-S DNA中
aprE promoter
Mlu I aprE SP
SP
Eco52 I pUB ori
pBE-S DNA
(5,938 bp)
Mlu I Eco 52 I双酶切将 Plasmid线形化
Multi cloning site（MCS） His-Tag
Kanr ColE1 ori Ampr
β-糖苷酶的活性测定
Barush 和Swiain 法 底物：水杨苷 荧光法 底物：4-甲基伞形酮
β-糖苷酶： 可以使糖苷或寡糖的 糖苷键水解
比色法 底物：对硝基苯基 β-D-葡萄糖苷
新比色法 底物：京尼平苷
……
随机选取470个克隆的培养上清进行β-糖苷酶的活性测定
根据活性测定结果，挑选24个菌落进行精制，测序，结果表明分泌蛋白水平与信号肽有关。
信号肽
1 2 3 4 研究背景
结构及作用机理
信号肽捕获系统 应用实例 展望
5
展望
医疗相关
2 1
蛋白生产相关
放飞思想 尽情展望
3
其他相关
4Biblioteka Baidu
细胞表面工程相关
统是目前从cDNA文库中筛选信号肽编码序列最好的系统.
信号肽
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结构及作用机理
信号肽捕获系统 应用实例 展望
5
TaKaRa相关产品-实验例：超耐热性酵素β-glycosidase 信号肽筛选
B. subtilis Secretory Protein Expression System (Code No.3380) B.枯草杆菌分泌蛋白表达系统 将目的基因(β-glycosidase的DNA序列) 和173种B. subtilis来源的信号肽插入载体，先转染大肠杆菌，增殖 获得质粒文库后,转染B. subtilis,获得分泌蛋白.
使用In-Fusion 反应插入 SP DNA mixture
目的基因
E.Coli Cell
转染 E. coli HST08 E.Coli Cell
37℃ ON
E.Coli Cell
E.Coli Cell E.Coli Cell
E.Coli Cell E.Coli Cell
E.Coli Cell E.Coli Cell
（3）在其C-末端靠近蛋白酶切割位点处常常带有数个极性氨基酸， 离切割位点最近的那个氨基酸往往带有很短的侧链（丙氨酸或甘氨 酸）。
分泌性蛋白质转运的信号假说：
5’ Cap AUG AAA3’
SRP
SRP receptor
Ribosome receptor Signal peptidase ER lumen
延伸
信号 假说 (signal hypothesis)
背景
信号假说
信号肽的发现
发现了 “信号识 别蛋白”
1999年度诺贝尔生理学或医学奖
信号肽
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结构及作用机理
信号肽捕获系统 应用实例 展望
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信号肽序列的特点
（1）一般带有10-15个疏 水氨基酸；
（2）在靠近该序列N端常常有1个或数个带 正电荷的氨基酸；
构建质粒文库
理想>2000个菌落 本制品可获得>1000个菌落
获得质粒文库
制备 B. subtilis 感受态细胞
50ul
0.5ml
50 ul 100 mM EGTA
宿主菌株
5-10 min
37℃ 90-100rpm
LB培养基 LB培养液 2 mL
37℃ 16hr
SP I mudium 5mL LB培养液 2 mL
段，理论上这些cDNA片段是能够编码信号肽的，这样就
实现了对分泌蛋白质的筛选。
信号肽捕获系统
哺乳动物细胞筛选系统(M-SST): SST-REX 该系统利用一种生长依赖IL-3存在的细胞系一Ba／F3进行筛 选。由于筛选是在哺乳动物细胞而不是酵母细胞中进行，所以 得到的信号肽的数量和可信度相对于suc2-SST要更高。该系
编写：张浩
周丹
2011.9月
secretion Endoplasmic reticulum Cell membrane
Golgi complex
不同类型蛋白质在细胞质合成后如 何转运到应该去的部位?
分选信号引导蛋白质到达正确的地点
分选信号有两类
1. 信号肽peptide signal：蛋白质多肽链上 的一段连续的特定氨基酸序列，具有分选 信号的功能。可位于多肽链的任何部位， 完成分选任务后常被切除。 2.信号斑plaque signa ：位于多肽链不同部 位的几个特定氨基酸序列经折叠后形成的 斑块区，具有分选信号的功能。信号斑是 一种三维结构。完成分选任务后仍然存在。
SP II mudium 4.5 mL
37℃ 16hr 37℃ 150-180rpm 170-180rpm
37℃ 90min 90-100rpm
形态转换
质粒文库
300 ul
B.subtilis
1 ug
感受态细胞
按目的蛋白的特性进行筛选
37℃ 90min 90-100rpm LB培养基
卡那霉素
37℃ ON
分选信号引导蛋白质到达正确的地点
信号肽
信号斑
信号肽
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结构及作用机理
信号肽捕获系统 应用实例 展望
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背景
发现
1972年Milstein等发现 免疫球蛋白IgG轻链的前 体要比成熟的IgG在N-端 多 20氨基酸。他们推测这 20个氨基酸可能和其通过 ER进而分泌有关
探索
Blobel从内分泌性蛋白质 向内质网转运入手研究蛋 白质转运的机制 ,发现了3 条重要线索 : 1. 被转运蛋白质的初生肽 (即其前身物)比成熟肽大 2.被转运的分泌性蛋白质 进入内质网的过程与其生 物合成的过程是平行进行 的 3.信号肽在内质网内被切 除。