紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较

紫外可见分光光度法与分子荧光光度法的比较

定义：紫外可见分光光度法：根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围（150～800纳米）单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法；

分子荧光光度法：利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析的方法。可以从发射光谱或激发光谱进行分析。

组成部件：紫外可见分光光度法：①辐射源。必须具有稳定的、有足够输出功率的、能提供仪器使用波段的连续光谱，如钨灯、卤钨灯（波长范围350～2500纳米），氘灯或氢灯（180～460纳米），或可调谐染料激光光源等。

②单色器。它由入射、出射狭缝、透镜系统和色散元件（棱镜或光栅）组

成，是用以产生高纯度单色光束的装置，其功能包括将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束。③试样容器，又称吸收池。供盛放试液进行吸光度测量之用，分为石英池和玻璃池两种，前者适用于紫外到可见区，后者只适用于可见区。容器的光程一般为 0.5～10厘米。④检测器，又称光电转换器。常用的有光电管或光电倍增管。。⑤显示装置。

这部分装置发展较快。较高级的光度计，常备有微处理机、荧光屏显示和记录仪等，可将图谱、数据和操作条件都显示出来。

分子荧光光度法：激发光源、单色器、样品池、检测器和记录显示部分。

1. 光源能发射紫外到可见区波长的光、强度大、稳定。常用的有溴钨灯、

高压汞灯、氙灯。2. 单色器，两个单色器。3. 样品池通常用石英制成。

4. 检测器：光电倍增管。

常见类型：紫外可见分光光度法：1.单光束。简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器

具有很高的稳定性。 2.双光束自动记录，快速全波段扫描。可消除

光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。

仪器复杂，价格较高。3.双波长。将不同波长的两束单色光(λ

、λ

1 ) 快束交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需

2

参比池。△ =1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。

分子荧光光度法：1. 光电荧光计用滤光片作单色器（激发滤光片

和荧光光片），溴钨灯或高压汞灯作光源，光电管为检测器。2. 荧光

分光光度计用氙灯作光源、光栅作单色器，光电倍增管为检测器。

可连续扫描激发光谱和荧光光谱。

原理：紫外可见分光光度法：紫外 - 可见吸收光谱通常由一个或几个宽吸收谱带组成。最大吸收波长（λmax）表示物质对辐射的特征吸收或

选择吸收，它与分子中外层电子或价电子的结构（或成键、非键和

反键电子）有关。朗伯-比尔定律是分光光度法和比色法的基础。这

个定律表示：当一束具有I0强度的单色辐射照射到吸收层厚度为b，

浓度为c的吸光物质时，辐射能的吸收依赖于该物质的浓度与吸收层

的厚度。其数学表达式为：式中的A叫做吸光度；I0为入射辐射强

度；I为透过吸收层的辐射强度；（I／I0）称紫藤为透射率T；ε是

一个常数，叫做摩尔吸光系数，ε值愈大，分光光度法测定的灵敏

度愈高。

分子荧光光度法：分子吸收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一

电子激发态或更高电子激发态的不同振动能级（这一过程速度很快，

大约10-15 s），成为激发单重态分子。激发态分子不稳定，可以通过

以下几种途径释放能量返回基态。1. 振动驰豫。这一过程只能发生

在同一电子能级内，即分子通过碰撞以热的形式损失部分能量，从较

高振动能级下降到该电子能级的最低振动能级上。由于这一部分能量

以热的形式释放，而不是以光辐射形式发出，故振动驰豫属于无辐射

跃迁。 2. 内转换。即激发态分子将多余的能量转变为热能，从较

高电子能级降至较低的电子能级。内转换也属于无辐射跃迁。3. 荧

光

较高激发态分子经无辐射跃迁降至第一电子激发单重态的最低振动

能级后，仍不稳定，停留较短时间后（约10-8 s，称作荧光寿命），

以光辐射形式放出能量，回到基态各振动能级，这时所发射的光称为

荧光。当然也可以无辐射跃迁形式返回基态。 4. 系间窜跃有些物

质的激发态分子通过振动驰豫和内转换下降到第一电子激发态的最

低振动能级后，有可能经过另一个无辐射跃迁转移至激发三重态，这

一过程伴随着自旋方向的改变，称为系间窜跃。对于大多数物质，系

间窜跃是禁阻的。如果分子中有重原子（如I、Br等）存在，由于自

旋-轨道的强偶合作用，电子自旋方向可以改变，系间窜跃就变得容

易了。荧光的检测：光源发出的紫外可见光通过激发单色器分出不

同波长的激发光，照射到样品溶液上，激发样品产生荧光。样品发出

的荧光为宽带光谱，需通过发射单色器分光后再进入检测器，检测不

同发射波长下的荧光强度F。由于激发光不可能完全被吸收，可透过

溶液，为了防止透射光对荧光测定的干扰，常在与激发光垂直的方向

检测荧光（因荧光是向各个方向发射的）。激发与荧光光谱的形成：

任何荧光物质，都具有两种特征光谱，即激发光谱(excitation

spectrum)和荧光发射光谱(fluorescence emission spectrum)。

荧光光谱，又称发射光谱。保持激发光波长不变（即固定激发单色

器），依次改变荧光发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧光强

度F。以发射波长为横坐标，以荧光强度F为纵坐标作图，得到荧

光发射光谱。荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最

大发射波长。

灵敏度：紫外可见分光光度法：灵敏度很高，达0.00001-0.0000001mol/L；

分子荧光光度法：由于分子荧光是从入射光的直角方向入射，因而灵

敏度要比紫外可见高2-4个数量级，它的测定下限

在 0.1-0.001ug/mL。

选择性：紫外可见分光光度法：一个物质若含有生色基团，它就会产生紫外和可见吸收，反过来根据紫外-可见吸收光谱便可判断某些官能团的存

在，即进行官能团的鉴别，紫外-可见吸收光谱的获得是建立在测定出

物质对不同波长光（单色光）吸收的基础上的。选择性较高。

分子荧光光度法：一个物质只要能产生荧光，则可以根据荧光光谱判

别物质的种类（前提是量子产率达到要求），因而选择性较高，但由

于不是所有物质都有荧光光谱，应用有一定限制。

影响因素：紫外可见分光光度法：1.共轭效应，共轭效应越强，能量差越小，最大吸收波长想长波方向，吸收强度也增大。2.立体化学校应，包括

空间位阻和跨环效应，均有影响。3.溶剂的影响，在溶液中物质是溶

剂化的，影响了溶质分子的自由转动，引起光谱结构精细结构的消失。

4.体系PH的影响，无论是酸性碱性，体系的PH对紫外可见光谱的影响

是普遍的现象。

分子荧光光度法：1.跃迁类型，物质必须在紫外可见区有强吸收和高

荧光效率才能产生荧光。具有π—π* 跃迁的分子才有强吸收。π—π*

跃迁的ε大。2. 共轭效应：大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或

杂环，具有共轭的π～π* 跃迁。其共轭程度愈大，荧光效率也愈大，