禽痘病毒用作疫苗载体
HPV疫苗研究进展
HPV疫苗研究进展宫颈癌致病因素是高危型人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染。
高危型HPV 基因组编码三个蛋白，E5，E6和E7，E6和E7主要在高级别病变和宫颈癌中表达，并是宫颈癌恶性表型发生和形成的必要条件。
疫苗的靶点是所有早期癌蛋白，因此癌蛋白E6、E7是HPV疫苗治疗的主要干预靶点。
目前，国际上已有多种HPV相关疫苗进入动物和临床试验阶段，HPV疫苗将在预防HPV感染及治疗由HPV感染所引起的相关疾病方面发挥重要作用。
标签：人乳头瘤病毒；疫苗；进展宫颈癌发病率居妇科恶性肿瘤首位，但由于宫颈脱落细胞学检查的普及，宫颈癌前病变及宫颈癌得到及早发现与治疗，尤其是发达国家还开展了人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）疫苗的接种，使浸润癌发病率明显减少。
子宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）的诊断大大提高宫颈癌患者的生存率以及改善患者对治疗的反应[1]。
持续的HPV感染增加癌细胞转化风险，持续高危型HPV感染可改变细胞周期，使细胞易出现基因不稳定和致癌基因突变。
在大多数情况下，免疫细胞可以清除这些感染，然而，只有一小部分的HPV感染者会发展为宫颈癌。
因此免疫缺失，突变或内在的基因组不稳定性可能是导致宫颈癌的发展。
现在，可以通过检测E6和E7 mRNA的表达评估宫颈癌[1，2]。
目前已确定的HPV型别有170种[3]。
国际癌症研究机构（IARC）进行的一项研究显示，有超过30000的宫颈癌患者参与此项研究，感染型别的调查结果显示：主要型别是16，18，58，33，45，31，59，39，52，35，51，56，其中HPV 16型感染>50%，HPV 16和18感染者>70%[1]，说明HPV 16和18是宫颈浸润癌最常见的类型[4]。
疫苗治疗是通过刺激细胞毒性T细胞作用于靶细胞、上调MHC-I的表達来消除或减少感染HPV的细胞，疫苗介导的免疫治疗是经过至少两个阶段直接作于癌变细胞，预防性疫苗旨在通过HPV抗体抑制HPV粘附细胞或进入细胞，从而阻止细胞感染HPV。
鸡痘病毒抗体在鹌鹑体内的消长规律
鸡痘 弱 毒 株首 先 经 Ｃ Ｆ适 应 ３代 ， 备 病 毒 悬 液 ， Ｅ 制
金 明 兰 等 ： 痘 病 毒 抗 体 在 鹌鹑 体 内 的 消长 规 律 鸡
－ ３ － — ７－ —２ — —
３００ｒｍｎ ０ ／ ｉ离心 １ ｎ 取上清 ， 病毒 液在 灭菌 Ｅ ｐｎｏｆ ０ｍｉ， 将 ｐ ｅｄ ｒ
支 装 有 ０ ９ｍＬＭＥ ． Ｍ维 持 液 的灭 菌 Ｅ ｐ ｎｏｆ 内 ， 分 振 荡 ｐ ｅｄｒ管 充 和 吹 打混 匀 后 ， 吸取 ０ １ｍ 再 ． Ｌ加 入第 ３支 装 有 ０ ９ｍ Ｍ ． ＬＭＥ 维 持 液 的灭 菌 Ｅ ｐ ｎｏｆ 内。 连续 如 此 操 作 ， ｐ ｅｄｒ管 即可 做 成 连 续 的 一 系 列 ｌ 稀 释 液 。 吸 取 每 一 稀 释 度 的病 毒 液 ０ １ｍ ， Ｏ倍 ． Ｌ 加 入 ９ 板 的培 养 孑 内 已 长 成 单 层 的 Ｃ Ｆ中 ， 个 稀 释 度 ６孔 Ｌ Ｅ 每 的病 毒 液 接 种 ８个 培养 孔 ，７℃ 培 养 １０ｈ 记 录 细胞 病 变 ， ３ ２ ， 发 生 细胞 病 变 的 记 “＋” 没 有 发 生 病 变 的 记 “一” 计 算 半 数 ， ， 组 织培 养 感 染 剂 量 （ Ｃ Ｄ 。 Ｔ Ｉ ）
水浴锅 、 光学显微镜 、 ｎｖｒａ １ Ｒ冷冻高速 台式离心机 Ｕ ｉｅ ｌ ６ ｓ （ ｉ ａ 、冷 冻 超 速 离 心 机 （Ｈ Ｔ Ｃ Ｉ 、Ｃ 培 养 箱 Ｓｇ ） ｍ ＩＡ Ｈ ） Ｏ
（ Ａ Ｙ 、Ｚ ８ ０型 紫外 可 见 分 光 光 度计 （ 州 无 线 电 仪 Ｓ Ｎ Ｏ）Ｔ Ｋ一 ０ 泰 器 厂 ） Ｓ Ｗ３０ 、Ｍ ８０微 波 炉 （ａａ ） Ｊｐ ｎ 。 １２ 病 毒 和试 验 动 物 ．
基因工程疫苗在动物疾病防治中的应用_杨天耀
基因工程疫苗在动物疾病防治中的应用杨天耀闰若潜多传染病严重威胁着动物和人类的健康，属于人和动物共患病、)由于很多疾病，尤其是病毒性疾病至今没有有效的治疗药物，因此疾病的预防工作就显得格外重要，疫苗的免疫接种自然成为控制人和动物传染性疾病的重要手段之一、)使用，一些传染病如天花、麻疹、牛瘟、牛肺疫、马传染性贫血等已经被消灭或得到有效控制，疫苗已成为人类同疾病斗一争的一种必不可少的重要武器。
口前用于人和动物传染病的疫苗，无论是灭活苗、弱毒苗或是亚单位苗，其研制都是以大量培养致病微生物为基础的，这不仅给疫苗制造带来了局限性，同时在疫苗的安全性、免疫原性、产量及保存等诸多方而也存在缺陷。
随着人类知识的不断进步，传统疫苗的局限胜也日益显露出来，主要表现为以下几个方而:①由于病毒的增殖需要在细胞中培养，使疫苗的生产成本很高;②疫苗可能存在病毒没有被完全杀死或充分减毒，因而造成散毒的可能;③所用弱毒疫苗菌株有可能会发生突变而使毒力返强;④有些疾病(例如艾滋病，肿瘤)用传统的疫苗防治收效甚微等。
因此，开发和研制更加安全、高效的疫苗显得十分必要和紧迫。
20世纪80年代后，随着现代分子生物学技术的兴起，特别是DNA重组技术的出现，为研制新型疫苗—基因工程疫苗提供了崭新的方法。
基因工程疫苗是利用基因工程技术去除病原体的无效和致病成份，保留能引起免疫保护作用的成分，从而比传统疫苗更安全有效。
此外，基因工程疫苗还具有如下优点:第一，可降低生产成本，更廉价更大批地生产。
第二，易于区分感染动物和免疫动物。
通过检测野毒中含有、而基因工程疫苗中没有的病毒蛋白的抗体，可以方便地从免疫动物中区分出野毒感染者。
第三，利用活载体可方便地制成多价联合疫苗，达到一针防多病的口的。
第四，应用重组DNA技术还有可能为口前尚无有效疫苗防治的某些特殊疾病，研制生产出有效的疫苗，从而达到预防这些传染病的口的、)基因工程疫苗的分类疫苗的发展史疫苗(vaccine)是通过诱发人或动物肌体产生特异免疫反应以预防或治疗疾病的一类生物制剂，其主要组分是能够刺激肌体产生特异性免疫反应的抗原。
生物安全
目录
1 概述 2 常用菌株的转基因操作 3 文献出处
概 述
• 动物用转基因微生物中引入或修饰性 • 实际插入或删除序列或区域的资料，大小，结构和功能的叙述 • 目的基因与载体构建的图谱，载体特性和安全性的叙述 • 载体中插入 区域个片段的资料，启动子和终止子的大小，功
痘病毒(fowlpox virus,FPV)载体在近几年受到越来越多学者的关注。 禽痘病毒载体的原理：是把外源基因插入到病毒的适当位置,通过同
源重组把外源基因重组到病毒基因组的复制非必需区域。外源基因 通过修饰等过程可以得到高效的表达,表达产物生物活性及相关功能 没有改变,刺激机体产生较强的免疫应答。 禽痘病毒被用作表达载体后,相继成功地表达了来源于禽类病毒、动 物病毒,乃至能感染人类病原体的保护性抗原基因,现已被广泛用作基 因工程的重要工具。【3】
转基因大肠杆菌表达生长激素
对于大黄鱼的研究，我国科学家已经知道大黄鱼得全基因组序列，因此安全问题可以保证！
痘苗病毒 已经开发为各种类型的表达载体
痘苗病毒（vaccinia virus）属痘病毒（Poxvirus）。在血清学和免疫学上 与天花病毒及牛痘病毒有密切关系，被用作天花预防疫苗的抗原。
痘苗病毒(vaccine virus,VV)是人们 较早开发的痘病毒载体,后来人们 对痘病毒（FPV）载体进行深入的 研究和应用,并取得了可喜的成果, 相继应用FPV载体表达了鹅副黏病 毒HN基因。
• 染色体外穿梭载体 ：1987年Jacobs等人首先构成穿梭载体，成功 的将外源基因导入rBCG中。无安全问题。
• 染色体整合载体：要想rBCG提供持久的免疫力，外源基因必须稳 定的保留在载体上，因此科学家研制出整合载体。再无抗生素选 择条件下，仍保持稳定。
鸡痘DNA疫苗pVAX-env的构建及其体内外表达
肤上发生痘疹 ，或在鸡 口腔 、咽喉部黏膜形成纤维 素性坏死性假膜。鸡只患该病后增重缓慢 、消瘦 ，
产 蛋 量暂 时 下 降［ ２ １ 。近年 来 ，鸡 痘 鹌 鹑 化 弱毒 苗 对 鸡 群进行 刺 种免疫 ，但常 出现 免疫 失败 ，鸡 群发 生
１ ＿ 重 组真核 质粒 的体 外瞬 时转 染 ．３ ２
１ 材 料 与方 法
１１ 材 料 ．
将 Ｂ Ｋ １细胞接 种 于 ２ Ｌ 中 ，在细 胞 达到 Ｈ ２ ４孑板 ８ ％的融 合 时 开始 转 染 。 取 ２ ｇ 组 质 粒 和 ２／ ０ 重 ｘ Ｌ
Ｌｐ ｆ ｔｍ ｎ 删 ０ ０ ｉｏｅ ａ ｉｅ ２ ０ ，分别 用 １ ０ｌ ｃ ０ Ｌ无 抗 生 素 、无 ｘ
１ 方法 ． ２
释 的 ＦＴ ＩＣ标记 的羊抗兔 Ｉ ｇ Ｇ二抗 ，室温避 光作用 ４ ｉ， Ｂ 清洗 ３ ；再用中性甘油封片， ５ ｎ ＰＳ ｍ 次 荧光显
微 镜 下 观 察 表 达 情 况 ，以 同 时 转染 Ｐ Ａ Ｖ Ｘ空 载体
的ＢＫ １ Ｈ ２ 细胞 为 阴性对 照 。 １ ． 重组 真核 质粒 的体 内试 验 ．５ ２
肌 肉注射免疫 １ 龄 雏鸡 ，通过 Ｒ — Ｃ ４日 Ｔ Ｐ Ｒ和 组织免疫 荧光检测体 内质 粒表达 。结 果表 明 ，成功构建 了真核 表达
质粒 ｐ Ａ — ｎ ，并证 明 ｐ Ａ — ｎ 在体 内体 外都 能有效表达。研 究为鸡 痘病毒基 因工程 疫苗进一步研制及 应用 Ｖ Ｘ ｅｖ Ｖ Ｘ ｅｖ
ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｆｔ ｅ ｐ ｏ ｅｎ ｗａ ｕ ｔ ｅ ｏｎ ｉ ｅ ｙ ＲＴ－ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｏ ｈ ｒ ｔ ｉ ｓ ｆ ｒｈ ｒｃ ｆｒ ｄ ｂ ｍ ＰＣＲ ｄ ｉ ｍ ｕ ｏｈｓｏ ｈ ａｎ ｍ ｎ ｉｔ ｃ ｅｍｉａ ｕ ｅ ｃ ｎ ｅ． ｅ ｃ ｌ ｏｒ ｓ ｅ ｃ Ｔｈ ｌ ｆ ｒ ｓ ｔ ｈ ｗｅ ｈ ｔ ｋ ｒ ｏ ｉ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｐａ ｍ ｉ ＶＡＸ－ ｎ ｓ ｓ ｃ ｅ ｓｕ ｌ ｏｎ ｔｕ ｔ ｄ ａ ｄ ｐ ｅ ｕｌ ｓ ｏ ｄ ｔ ａ ｓ ｅｕ ａ ｙ ｔ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｌｓ ｄ ｐ ｃ ｅ ｖｗａ ｕ ｃ ｓ ｆ ｌ ｃ ｓｒ ｃ ｅ ， ｎ ＶＡＸ— ｖ ｙ ｅｎ ｗａ ｂｅ ｔ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓ ｄ ／ ｉ ｏ ａｎ ／ ｖｖ ．Ｔｈｉ ｅ ｅａ ｃ ａ ｅ ｈ ｙ ｆ ｒｔ ｅ ｆ ｒｈ ｔ ｄ ｎ ｓ ａ ｌ ｏ ｂ ｘ ｒ ｓ ｅ ｎ ｖｔ ｄ ｎ ｉｏ ｒ ｓ ｒｓ ｒ ｈ ｐ ｖ ｄ ｔ ｅ ｗａ ｏ ｈ ｕ ｔｅｒｓ ｕ ｙ ａ ｄ
鸡组织中沙门氏菌的分离鉴定与药物筛选
禽沙门氏菌病，是一个概括性术语，指由沙门氏菌属中的任何一个或多个成员所引起禽类的一大群急性或慢性疾病。
在所有动物中，最常报道的沙门氏菌来源于家禽和禽产品。
禽沙门氏菌病是养禽业各个时期都值得关注的重要疾病问题。
因此，定期进行沙门氏菌分离培养和耐药性检测很有必要。
1试验方法1.1细菌分离无菌采集具有典型沙门氏菌感染病症鸡的肝脏和脾脏，将病料的新鲜截面在SS 琼脂培养基的表面轻轻涂抹均匀，将涂好的培养基放在恒温箱中，37℃下培养24h 。
在培养基上选取12个淡红色、圆形、表面光滑、湿润、较大、中心黑色、边缘透明的菌落，分别接种于盛有营养肉汤的试管中，编号1～12号后放在恒温箱中，37℃下培养24h 。
1.2PCR 试验[1-4]1.2.1引物来源及设计参照沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因序列，此基因序列是沙门氏菌属的高度保守序列。
用软件Primer 5.0设计l 对引物，长度为25bp ，两引物间核苷酸长度为234pb 。
引物I ：5'-ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GCT G-3'。
引物Ⅱ：5'-ATG ，TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A-3'。
预计扩增产物的长度为284pb 。
1.2.2扩增取无菌0.5mL 离心管十二支，编号1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12。
向每支离心管中分别加入上游引物1μL ，下游引物1μL ，dNTPs 4μL ，10×buffer 5μL ，水36.7μL ，Taq 酶0.3μL 。
然后在1～12号离心管中各加与之对应的菌液2μL 。
将上述混合液稍加离心，立即置PCR 仪上，执行扩增。
在94℃预变性7min ，进入循环扩增阶段，94℃30s ，47℃30s ，72℃45s ，循环30次，最后在72℃保温10min 。
反应结束，PCR 产物放置于4℃待电泳检测。
1.2.3电泳配置0.8%琼脂糖凝胶，溶化后加5μL EB ，倒板，取5μL pcr 扩增产物加1μL 缓冲液上样，点上marker 后放进电泳槽，将电压调到140伏特，开始电泳。
鸡痘病毒载体研究进展
１ ．ｋ ｎ Ｏ ８ ｂ Ｈｉ ｄ Ｉ片段 中有两 个ＯＲＦ 的启动子含有 与痘苗病 毒启动 子ＴＡＡＡＴ 相似的 结 构
Ｔ Ａ Ｔ 。Ｆ Ｖ ４枕心多肽启动子也含有与 Ａ Ａ Ｇ Ｐ ｂ 痘苗病 毒相同的 Ｔ Ａ Ｔ 的晚期启 Ａ Ａ 竺
动子序列 。在 １ ．ｋ Ｐ Ｂ ｍＨ Ｉ片段 中， ２ ／ＯＲ １ ２ ｂ Ｆ Ｖ－ ａ ０卜 Ｆ的上游 １ ０ ｐ ３ Ａ 十Ｔ ０ｂ 含８ ，这 与
比，其氨基酸组成含有 较多 的丝 氨酸 和缬氨酸 ，但 谷氨酰胺和脯 氨 酸较少 。Ｆ Ｖ 螗的 核心 Ｐ 区域 与天花病毒和猴痘病毒埔的核 心区 域 的 同 源性为４ ． ，Ｆ Ｖ ｔ可 以拯救ｆ 痘苗 病 ８６ Ｐ ｋ 毒ｃ， Ｉ Ｐ 因两侧 的序列 与痘苗病 毒ｆ基 因两 侧 的 序 列差 异较大（ 痘苗病毒ｆ ５６ 但Ｆ Ｖ ｆ 基 ３ ＾ ¨。 基因不能 与ＦＰ ＾ ＤＮＡ片段 杂交（］ Ｖ ｆ ７。编码ＦＰ ｂ 心多 肽基 因含 ｌ７ 个核苷 酸， 产 Ｖ ４核 １ ９ 其 物比痘苗病毒 ４ 核心多肽 稍长，两 者有５ 的 同源性 。Ｆ Ｖ ＲＮＡ聚台酶 基因 和 ＤＮ Ａ 聚 ｂ ２ Ｐ 合酶基 因与痘苗病毒 的相应基 因也存在较 高的同源性 ［ ８。对 １ ．ｋ Ｐ Ｈｉ ｄ Ｉ片 段 ３ｊ ， ０ ５ ｂ Ｆ Ｖ— ｎ
１ 北 京 军 区 后 勤 兽 医 拴 验 所 ． ２ 长 春 兽 医 尤 学 医 研 究 所 ．
收稿 日期 ｌ １ ９ 年５ １ ｆ １ 月２ 日，同 年 月２ 日 回． ｌ ２ 修
８期
鸡 痘病毒 载 体 研 究进展
２１ ０
进行分析，其 与痘苗病毒 的Ｈｉ ｄ ＩＤ片段 有５ ｎ 个ＯＲＦ 因产物 的氨基酸序列 同源，但 此 区 基 域不含有痘苗病毒编码 的非必需转膜蛋 白基因［ 。以上说 明了痘病毒在进化上 的相 关性 。 ９ ］ Ｆ Ｖ基因组 的束端结构 与痘苗病毒相 似之处在于， 它们都含 有共价结合的发夹 结 构， Ｐ 富 含 Ａ 十Ｔ及 重 复 序 列 ， 并 含有 病 毒 复 制 的非 必 需 区 基 因 。 对 １ ．ｋ Ｖ－ ｍＨ Ｉ片 段 １２ ｂ ＦＰ Ｂａ 的分 析发 现，Ｆ Ｖ的３ Ｐ 个ＯＲ 基 因产物 与痘苗病 毒的３ Ｆ 个ＯＲ 基 因产物， 即４ ｋ Ｆ ２ 早期 基 因， ３ ．ｋ 主 范 围基 因和 ３ ｋ 血 基 因产 物 同源 。６ ２ ＦＰ Ｂａ ２５ 宿 ８ 出 ．ｋ Ｖ— ｍＨ Ｉ片段 中 的 颠 倒 重 复 序
禽痘病毒载体及其应用
禽痘病毒载体及其应用孙鹏;王云峰;胡桂学【摘要】禽痘病毒(fowlpox virus,FPV)载体在近几年受到越来越多学者的关注.禽痘病毒载体的原理,是把外源基因插入到病毒的适当位置,通过同源重组把外源基因重组到病毒基因组的复制非必需区域.外源基因通过修饰等过程可以得到高效的表达,表达产物生物活性及相关功能没有改变,刺激机体产生较强的免疫应答.禽痘病毒被用作表达载体后,相继成功地表达了来源于禽类病毒、动物病毒,乃至能感染人类病原体的保护性抗原基因,现已被广泛用作基因工程的重要工具.作者就禽痘病毒粒子的结构、生物学、分子生物学、禽痘病毒载体及其应用等几个方面进行了阐述.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(037)009【总页数】4页(P82-85)【关键词】禽痘病毒;载体;应用【作者】孙鹏;王云峰;胡桂学【作者单位】吉林农业大学动物科技学院,长春,130118;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,哈尔滨,150001;吉林农业大学动物科技学院,长春,130118【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.1近年来,随着对痘病毒分子生物学深入的研究,禽痘病毒载体受到诸多学者的青睐。
痘苗病毒(vaccine virus,VV)是人们较早开发的痘病毒载体,后来人们对FPV载体进行深入的研究和应用,并取得了可喜的成果,相继应用FPV载体表达了鹅副黏病毒(goose paramyxovirus,GPMV)H N基因(杨玉菊等,2009)、鸡贫血病病毒(chick anaemia virus,CAV)凋亡素基因(管国芳等,2009)、鸡白细胞介素18(陈红英,2008)、鸡二型干扰素(chicken typeⅡinterfern,IFN-γ)(Sun等 ,2005)、恶性疟原虫(plasmodium falciparum)环包子蛋白(Walther等,2006)等保护性抗原基因。
FPV载体作为一种非复制型载体,高效、安全。