免疫原和抗体的制备

O菌体抗原
二、可溶性抗原制备及鉴定
•可溶性抗原: 蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、 脂多糖、细菌外毒素和核酸 •来源: 组织、细胞或血液，其成分较复杂。
制备流程：
预处理
器官组织：
组织碎块
组织细胞：
细胞的破碎
血 液：
抗原的分离 及纯化
抗原的鉴定 返回
1、组织材料的预处理
组织必须是新鲜或低温保存的
四、佐剂
英文全称：immunoadjuvant 概念：
与抗原同时或预先注射于机体，能增加 机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。
一) 佐剂的种类
化合物:氢氧化铝、明矾、矿物油、吐温-80、 弗氏不完全佐剂以及人工合成的多聚肌苷酸∶ 胞苷酸(poly I∶C)、脂质体
生物制剂:处理改造的细菌及代谢产物，如卡 介苗、短小棒状杆菌、百日咳杆菌及CTB、LPS 和类脂A、胞壁酰二肽等；细胞因子及热休克蛋 白
• 原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附 交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的 等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的 能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相 的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维 素上的电荷位 置，从而使血清中的蛋白质分成γ 球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等几个部 分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。
2)盐析法
• 原理：白蛋白可溶于半饱和的硫酸铵溶液中， 而球蛋白则沉淀析出；该达到饱和时，白蛋白也析 出，因此不同饱和度的硫酸铵或硫酸钠，可将白蛋 白和球蛋白分离。 • 方法：用50、33%的硫酸铵分次提取，即可获得 丙种球蛋白(含IgG 95%以上) 。
• 特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。
免疫原和抗体的制 备
概要
• 第一代抗体：多克隆抗体 • 第二代抗体：单克隆抗体 • 第三代抗体：基因工程抗体
第一部分 多克隆抗体制备
英文全称：polyclonal antibody,PcAb 定义：它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖 分化所产生的抗体，是多种抗体的混合物。 如何制备？是通过给动物接种抗原所获得的免疫血 清或抗血清。
5)亲和层析法（蛋白A纯化IgG）
上样
静置30分钟
蛋白A 琼脂糖
注：上样速度慢
结合缓冲液冲洗
洗脱缓冲液冲洗
•优点：纯度高、获得物不失活性，简便快捷。 返回
纯化抗原的鉴定
4、纯化抗原的鉴定
返回
1).含量鉴定
2).理化性质鉴定 ①凝胶层析技术测定 ②聚丙烯酰胺凝胶电泳 ③凝胶管状电泳 ④超速离心
3).纯度鉴定 常用醋酸纤维膜电泳 4).免疫活性鉴定 常用双向琼脂扩散试验
离
析
1)1．)超超速速离离心心法法
• 原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降 速度的颗粒,处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。
• 特点：用差速离心或梯度密度离心 法纯化抗原，极难将某一抗原成分分 离出来。
转速大于20000r/min
• 应用：用于少部分大分子抗原IgM、 C1q、甲状腺球蛋白、载脂蛋白A、B等。 不适于中、小分子量蛋白质。
胞作用较差。
1.酶处理法
4)酶处理法
• 常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 • 方法：在一定的条件下，能消化细菌和组
织细胞。 • 特点：①此法适用多种微生物；
②具有作用条件温和； ③内含物成分不易受到破坏； ④细胞壁损坏的程度可以控制。
5)表面活性剂处理
• 原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条 件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡， 使膜的渗透性改变或使之溶解。
特点：①操作简单，重复性较好，节省时间； ②多用于组织细胞和细菌的破碎。
3)反2.复冻融法 冻融法
• 原理：因速冻缓融，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂浓度突然改变而破坏细胞。
• 方法：将待破碎的细胞置-20℃冰箱内冻 结，然后室温融化，如此反复3-4次，大部 分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。 • 特点：此法适用于组织细胞，对微生物细
上清液 澄清
2000r／min
去wenku.baidu.com细胞碎片 离心 取上清液 及微小组织 15000r／min
•特点：①操作简单，无需贵重仪器； ②多用于内脏组织的破碎。
2)超声破碎法
原理：利用超声波的机械振动产生的压力足以 使细胞破碎。 方法：使用的频率从1kHz～20kHz不等的超声波 处理细胞，间歇进行，避免长期超声产热，导 致抗原破坏。
• 应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。
3)3凝．胶凝层胶层析析法法（（凝凝胶胶过过滤滤法法））
•原理：利用凝胶的多孔网状结构， 大分子在凝胶颗粒间很快通过，小分 子进入网孔，难于洗脱，将抗原分为 大、中、小三种。属区带分离法。
• 特点：是根据分子大小分离蛋白质 混合物最有效的方法之一。
4)离子交换层析法
• 常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、 二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯 （非离子型）、新洁尔灭等。
• 应用：①破碎细菌，且作用比较温和； ②提取核酸时，常用此法破碎细胞。
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3、蛋白质抗原的提取与纯化
蛋白质、 多糖、脂 类、核酸
蛋白质
超盐凝离亲
速析胶子和
离沉过交层
心淀滤换析
分
层
洗去血迹 及污物
脏器进行灌洗
NS内含0.5g／L NaN3
冷浴中组织剪碎
组织碎块
去除包 膜或结 缔组织
2、细胞破碎技术及评价
物理法 化学法
1)高速捣碎法 2)研磨法 3)超声破碎法 4)反复冻融法 5)酶处理法 6)表面活性剂处理
1)高速捣碎法
组织碎块
1000r／min
装入捣碎机简内高速 粉碎制成组织匀浆液
特点：制作方法较为简单； 悬液呈浑浊状或乳浊状； 免疫时多用静脉注射，不需佐剂
NS稀释至 2～5%
绵羊红细胞的制备流程图
摇动 1520min
周可
4℃
保
存
3
NS洗涤3 次 2000r/mi n
10min
取适量
100℃水浴 2～2.5h 杀菌
无菌试验
液体培养或 斜面培养 37℃24h
细菌菌体抗原的制备流程图
人体
Ag
B
B
Ag
Ag Ag
B
免疫血清制备机制
人体
免疫原(及佐剂)的制备
抗血清的保存
免疫动物
抗血清的鉴定
试血
抗血清的纯化
采血收集血清
一、免疫原的制备
免疫原(immunogen)是能诱导机体产生 抗体并能与抗体发生反应的物质 一)颗粒性抗原的制备 二)可溶性抗原制备及鉴定 三)半抗原免疫原的制备
细胞抗原：绵羊红细胞 细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原 寄生虫体抗原：虫卵