第四章 寄生虫及寄生虫病研究新技术、方法

第四章寄生虫及寄生虫病研究新技术、方法

当今科学技术快速发展，多种学科和新兴领域相继涌现，不断产生新的交汇点和生长点，从中引发出重大科学问题，逐渐形成了现代医学的前沿领域，这些领域的研究成果已成为寄生虫学发展的重要推动力。将医学前沿研究与寄生虫病防治实践相结合，始终是寄生虫学工作者关注和工作的重点。

本章节简要介绍分子生物学和免疫学的一些前沿领域研究的新技术和新方法,为寄生虫病研究提供新思路。

一、分子生物学

1．基因组学和后基因组学的研究

人类基因组研究计划（Human Genomic Project , HGP）于1990年正式开始实施，主要科学目标是研究基因组的结构，绘制遗传连锁图、物理图、序列图和转录图。近年来寄生虫基因组的研究已经开始，其中疟原虫和溶组织阿米巴基因组计划已宣布全部完成。血吸虫，包虫等还在进行中。主要内容有新基因的发现，物理图谱的制作，cDNA微型矩阵的制作，线粒体基因的测序以及生物信息学的研究等。应用于血吸虫基因组计划研究采用的主要技术有荧光原位杂交（FISH），表达序列标签（EST），DNA芯片微阵技术（chip microarray）。

随着基因组计划的即将完成，目前已开始进入“后基因组学”时代，即识别和鉴定基因组的功能信息。后基因组学研究内容主要有：基因的识别和鉴定以及基因功能信息的提取和鉴定。目前识别基因的生物学手段主要基于以下原理和思路：①根据已知基因序列资料。②根据可表达序列标签（EST）。③对染色体特异性cosmid进行直接的cDNA选择。④根据CpG岛。⑤差异显示及相关原理。⑥外显子捕获及相关原理。⑦DNA微芯片技术。该技术可用于任何位点基因突变、缺失和插入等的鉴定，感染性疾病和肿瘤的检测，易患倾向基因的检测，新基因的发现，基因作图和基因表达研究等方向。DNA芯片技术在蚊虫抗性基

因和疟原虫耐药基因的研究等项目中已经应用。⑧基因组扫描。⑨突变检测体系。基因功能信息的提取可采取下列方法：①绘制基因图，包括所有的基因及等位基因，系统鉴定基因突变体。②绘制基因表达谱，采用微点阵技术（microarray）、定量PCR、原位杂交及计算机参与，用于定量分析基因表达水平。③基因敲除（gene knock out）或转基因动物的建立，用以检测模式生物的生物学功能改变，这是了解特定基因功能的重要途径之一。④探测蛋白质水平、修饰状态和相互作用。采用双向凝胶电泳和质谱法相结合，并通过蛋白质数据库比较的方法识别蛋白质片段，检测磷酸化和糖基化二级修饰。采用DNA靶检测技术，构建基因组相互作用图。采用X线衍射技术和核磁共振技术对蛋白质进行空间构型分析，以研究蛋白质结构与功能的关系，并判断相关基因的结构与功能关系。采用显微镜定位定量技术和FISH、Confocal等新技术对蛋白质的结构与功能及相互作用进行分析，以了解基因的结构与功能的关系。

其它应用的方法还有酵母人工染色体（YAC）、聚类分析技术（cluster analysis）、细菌人工染色体（BAC）、猎枪测序法（shotgun sequencing）、序列标签位置（STS）等。

2．细胞凋亡

细胞凋亡（apoptosis）与细胞坏死性死亡意义不同，凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，结束生命的过程。

已经发现三类细胞凋亡相关基因，即在细胞凋亡过程中表达的基因，促进细胞凋亡的基因和抑制细胞凋亡的基因。已经证实细胞凋亡过程是受基因调控的，是主动连续的程序化反应。利用分子生物学和细胞生物学的新技术，从分子水平上深入揭示细胞凋亡的启动、发生和发展规律，可研究寄生虫在人体内的发育，宿主的免疫防御，超敏反应等机制。最近日本血吸虫虫卵肉芽肿的细胞凋亡研究已经开始。一般说来，细胞凋亡的测定方法可分为形态学、生物化学、免疫化学、组织化学和分子生物学的方法，其中分子生物学方法灵敏度高，在细胞凋亡研究中被广泛采用。由于细胞凋亡中染色体DNA断裂是个渐进的、分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50～300kb的大片段，然后约30%的染色质DNA在Ca++、Mg++依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或某一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、硷性磷酸化物酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有

3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞或凋亡小体进行原位染色，能准确地反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，不仅可检测出极少量的凋亡细胞，而且可用于进行石蜡包埋或冰冻的组织切片以及新鲜的或体外培养的组织的细胞凋亡测定。

3．糖生物学

糖类是自然界中分布最广的有机分子，除了简单的多糖外，糖类还和许多其它生物分子形成复合物。复合糖类根据其组分可分为糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂、脂多糖等类型。复合糖类存在于寄生虫细胞表膜、细胞间质和多种循环分泌排泄物中。核酸也是一种复合糖，因为核酸的骨架就是核糖链和脱氧核糖链。在细胞质和细胞核内发现了一种新的糖基磷脂酰肌醇化蛋白，GPI(glycosylphosphatidylinositol)，在曼氏血吸虫Sm23成虫表膜以及许多原虫表面抗原，如锥虫表膜抗原变异体（VSG）、疟原虫裂殖体的表面抗原和蛋白酶中均已检出。目前研究较多的是糖蛋白，蛋白中的糖链和肽链的连接方式有两种：N-糖苷键和O-糖苷键。曼氏血吸虫循环阴极抗原（CCA）存在N-糖苷链，而循环阳极抗原(CAA)不存在N-糖苷链。曼氏血吸虫雄虫合成的糖蛋白含有O-糖苷链。

开展糖生物学研究，首先要检测糖复合物的存在并进行组分分析，糖复合物的检测包括糖部分和非糖部分。糖类的检测比蛋白质和核酸更为复杂，这是因为糖类没有特征的吸收光谱，不能用分光光度法进行检测。糖类的检测通常都是利用特殊的化学反应使糖类显色，然后再比色测定。但是即使是简单的单糖因其所含羟基的不同和其它取代基的存在，也无法用统一方法进行检测。要了解糖复合物的结构和功能以及进一步研究其合成和调控，还需应用糖复合物的分离纯化技术，对其组成分析和测定后方可测定各个组分的结构，不但要测定糖链的结构，还需了解糖链和非糖部分的连接情况，尤其是糖蛋白。糖类复合物和其它生物分子一样，只有在和其它分子相互作用时，才能体现它们的功能，因此功能研究应包括糖链的相互作用以及作用中的其它非糖类的重要成分。最终可用改造糖链结构和糖基化工程制备糖复合物。这一方面的研究虽然刚刚起步，但发展趋势令人注目，为糖复合物的疫苗和药物研制提供了一条新途径。

二、免疫学