木质素降解酶的研究进展_胡雪竹

木质素是一种最丰富的可再生大分子有机物，一般的微 生物很难分解，因此，木质素的降解也是能否有效利用纤维 素的关键［1］。降解木质素不仅可以缓解环境污染，还可以变 废为宝，实现资源再利用［2］。近几年来，关于木质素的研究 越来越深入，人们对于木质素的认知也越来越清晰。张辉等 认为木质素是由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键连接而成的 聚酚类三维网状高分子芳香族化合物，结构复杂，分子量大， 是自然界中仅次于纤维素的最为丰富的有机物［3］。典型木 质素的基本结构单元的先体醇大致包括 3 种： 松柏醇、芥子 醇和对 － 香豆醇［4］。 1 木质素降解酶的种类
黄孢原毛平革菌中编码 MnP 的 3 个同工酶基因分别为 mnp1、mnp2 和 mnp3，其中 mnp1 编码 H4 蛋白，mnp2 编码 H3 蛋白，关于 mnp3 基因的报道较少。Margaret 等对黄孢原毛 平革菌中编码 mnp3 的基因进行了克隆和测序，结果表明，
39 卷 11 期
胡雪竹 木质素降解酶的Βιβλιοθήκη Baidu究进展
在分子生物学研究中，主要分为新基因的发现、测序以 及外源表达 3 个方面。 3． 1 木质素降解酶的基因克隆 3． 1． 1 过氧化物酶基因克隆。黄孢原毛平革菌编码 LiP 的 基因组成已基本明确，其 LiP 家族由至少 10 个结构上紧密关 联的基因编码，它们分别被命名为 lipA ～ lipJ，定位于 4 个连 锁群，每个基因还有不同形式的等位基因。Stewart 等建立了 liP 基因的物理图谱，4 个基因 lipA、lipB、lipC、lipE 定位于一 个 35 kb 的区域，lipG、lipH、lipI、lipJ 定位于一个 15 kb 的区 域，lipD 和 lipF 不与其他的基因相连［14］。
要为 Cu 和 Mn。其中 Cu 对漆酶的产生和酶活性密切相关， Mn 在 MnP 的合成中至关重要。许多研究表明，较低浓度的 Mn2 + 有利于微生物产生 LiP，向培养基中添加 Cu2 + 的浓度超 过 1 μmol / L 时会抑制微生物产生 LiP。肖亚中发现，发酵培 养基中不添加 Cu2 + 时，漆酶产量很低，0 ～ 5 μmol / L 范围内， 酶活性水平随 Cu2 + 浓度的增加迅速提高，当大于 10 μmol / L 时，漆酶的产量降低，说明适量的 Cu2 + 可促进菌株漆酶的合 成，过多则抑制漆酶的合成［27］。李华钟等在对黄孢原毛平 革菌产酶研究中发现，在培养基中添加适当浓度的 Mn2 + ，在 3 ～ 5 d 后，即可检测到 LiP 的活性，菌丝球上沉积有 MnO2 ， 也可保护 LiP 免受 H2 O2 的毒害，表明适量的 Mn2 + 可以提高 LiP 的活性； 培养基中缺乏 Mn2 + 时，细胞可以合成藜芦醇，也 可诱导 LiP 的产生，而且还可以保护 LiP 免受 H2 O2 的毒害， 因此，细胞也可以合成一定量的 LiP； 当细胞中含有过量或微 量的 Mn2 + 时，细胞均不能合成 LiP［28 －29］。 4． 3 诱导物和表面活性剂 诱导物和表面活性剂在木质 素降解酶的合成中具有重要作用。诱导物不仅能诱导木质 素降解酶的产生，还起到分散剂和保护剂的作用，研究较多 的是藜芦醇。表面活性剂主要是提高细胞膜的渗透性，研究 最多的是吐温 80。胡道伟等在对杂色云芝产漆酶条件的研 究中，分别用单宁酸、愈疮木酚、甲苯胺、二甲苯胺作为诱导 剂，选用吐温 20、60 和 80 为表面活性剂，结果表明，诱导剂 二甲苯胺和表面活性剂吐温 80 效果最好［30］。Grgic 等研究 结果表明，聚乙烯醇（ 如 PEG10000） 可刺激木质素过氧化物 酶的合成，但灭菌后由于部分降解，分子量下降，其刺激作用 有所下降［31］。 4． 4 其他因素 影响木质素降解酶活性的还有一些其他 因素，如接种量、pH、培养温度、接种物、代谢产物等。培养温 度和 pH 对酶合成的影响因菌种的差异而不同。
另外，芳醇氧化酶（ Aryl-alcoholoxidase，AAO） 、乙二醛氧 化酶 （ Gyoxaloxidase，GLOX） 、葡 萄 糖 氧 化 酶 （ Gucose-l-oxidase） 、酚氧化酶、过氧化氢酶、新阿魏酰酯酶、对 － 香豆酰酯 酶也与木质素的降解密切相关［7］。 2 木质素降解酶的作用机理 2． 1 木质素过氧化物酶（ LiP） 和锰过氧化物酶（ MnP） LiP 和 MnP 都是带有糖基的胞外血红素蛋白，又称血红素过氧
木质素的生物降解在地球碳循环中有着极为关键的作 用，与木质素降解有关的酶最早在白腐真菌的胞外培养液中 发现。1978 年，Keyser 等用木质素降解酶系统（ 1igninolytic enzyme system） 来概括对木质素降解起作用的这些酶［5］，尽 管当时并未分离到与降解活动直接有关的酶。1983 年，Tien 等在《Science》上发表研究论文，第 1 次报道了提取出的木质 素降解酶［6］。
基金项目 作者简介 收稿日期
河南省科技厅重点攻关项目（ 092102110191 ） ； 河南省教育 厅资助项目（ 2010B180022，2011B180041） 。 胡雪竹（ 1969 － ） ，女，河南登县人，中级农艺师，从事农业生 物质资源化研究。 2011-01-14
化物 酶。两 者 都 需 要 H2 O2 催 化，MnP 还 要 有 Mn2 + 的 参 与［8］。菌丝在生长过程中分泌出 LiP 和 MnP，由于酶的催化 作用，木质素结构中的苯环发生单电子氧化反应形成苯氧自 由基，随后发生一系列非酶催化的自由基反应而降解，包括 甲氧基的脱除，侧链上 Cα -Cβ 、Cβ -Cγ 及烷基芳基醚键的断 裂［9］，直至苯环的裂解等。木质素的降解产物再被菌丝体吸 收，进一步氧化成 CO2 和 H2 O［10］。由于 MnP 的氧化还原电 位较低，只能氧化酚型结构的木质素。而 LiP 有非常高的氧 化还原电势，是迄今为止发现的唯一一种可以单独氧化降解 非酚型木质素结构的过氧化物酶。 2． 2 漆酶（ Laccase） 大部分真菌除产生 LiP 和 MnP 外， 还能产生漆酶。漆酶是含铜的氧化酶，分漆树漆酶和真菌漆 酶 2 类［11］。由于漆酶的含量较高，难以得到它的 X 射线衍 射图，所以它的三维空间构象还不十分清楚［12］。但作为一 种多酚氧化酶，它在分子氧存在时能使羟基脱去质子形成酚 氧阴离子，引起木质素酚型结构单元侧链断裂，包括 C － C 键、脱甲氧基、脱羟基等，铜在其中起决定作用［13］。漆酶降 解木质素不需要 H2 O2 参与，因此有一定的优越性。但漆酶 由于其氧化还原电位较低，不能氧化占木质素含量 90% 的非 酚型木质素，只能氧化木质素的酚型结构单元。但在低分子 物质作为介质时，漆酶也可以氧化非酚型结构的木质素。 3 木质素降解酶的分子生物学研究
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mnp3 基因编码的蛋白（ 357 个氨基酸） 带有 1 条 25 个氨基酸 组成的信号肽［15］。在 mnp3 蛋白中含有酶活性部位、Mn2 + 结 合位点和形成二硫键的氨基酸。mnp3 基因包含有 6 个内含 子，其启动子包括金属反应结构和热休克结构，这些结构与 mnp 基因转录被含锰底物调节和热休克密切相关。另外， Luis 等研究表明，黄孢原毛平革菌中的 nop 基因能编码一种 新型的过氧化物酶，包含 295 个氨基酸残基，比其他 Ⅱ 型过 氧化物酶（ 如 LiP 和 MnP） 要短［16］。 3． 1． 2 漆酶基因克隆。Chen 等用 RT-PCR （ 反转录多聚链 反应） 对 Volvariella volvacea 中编码漆酶的 cDNA 进行克隆并 进行了扩增，发现 lac4 基因为 1 689 bp，能编码 23 个氨基酸 组成的 N － 末端信号肽和 1 个 540 个氨基酸组成的成熟蛋 白。编码的氨基酸序列和其他担子菌的漆酶相似，但其转录 不受铜或芳香族复合物的调节［17］。Okamoto 等对日本的糙 皮侧耳野生型菌株中编码漆酶的基因 lccK 进行了克隆、测序 并进行了分析，结果表明，该基因（ 2 929 bp） 编码区有 19 个 内含子，上游具有 CAAT 和 TATA 元件并且和其他担子菌中 编码漆酶的相关基因具有高度同源性［18］。 3． 2 木质素降解酶相关基因的外源表达 自从 1998 年，黄 孢原毛平革菌编码 LiP 的 DNA 在 E． coli 中成功获得表达以 来［19］，木质素相关基因异源表达发展迅速。国内外许多专 家对编码多铜漆酶的基因进行了分离，经过克隆后在 E． coli 中进行了表达，其所编码的蛋白质有一信号肽和 4 个 Cu 结 合位点［20］，另外，在 N-末端还有 2 个 Cu 结合位点。该蛋白 质具有漆酶和酪氨酸酶的活性。王海宽等以黄孢原毛平革 菌 RNA 为模板，克隆 LipH8 基因片段，并完成 LipH8 基因在 甲醇毕赤酵母中的表达，经摇瓶培养筛选出表达水平较高的 酵母工程菌株，胞外木质素过氧化物酶活力达 932 U［21］。 4 木质素降解酶的营养调控研究
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39（ 11） ： 6326 － 6328，6363
责任编辑 张彩丽 责任校对 马君叶
木质素降解酶的研究进展
胡雪竹 （ 南阳农业学校，河南南阳 473000）
摘要 从木质素降解酶的组成、作用机理、分子生物学研究、营养调控研究 4 个方面对木质素降解酶研究新进展进行了综述，并对木质 素降解酶在工农业固体废弃物处理方面的应用做了展望。 关键词 木质素； 木质素降解酶； 作用机理； 分子生物学； 营养调控 中图分类号 S 183 文献标识码 A 文章编号 0517 － 6611（ 2011） 11 － 06326 － 03
Reach Advance of Ligninolytic Enzymes HU Xue-zhu （ Nanyang Agricultural School，Nanyang，Henan 473000） Abstract The paper reviews the research advance of ligninolytic enzymes from its composition，action mechanism，molecular biology research and nutrition regulation，and forecasts the application prospects of ligninolytic enzymes in the disposal of agricultural and industrial solid waste． Key words Lignin； Ligninolytic enzyme； Mechanism of action； Molecular biology； Nutrition regulation
目前，关于木质素降解酶的研究工作主要集中在白腐菌 所产生的酶系，研究最多的有 3 种： 木质素过氧化物酶（ Lignin Peroxidase，LiP） 、锰 过 氧 化 物 酶 （ Manganese Peroxidase， MnP） 和漆酶（ Laccase） ，它们分别代表一系列的同工酶。通 常，白腐菌降解木质生物质原料的过程分为 2 个阶段： 首先 菌丝分泌纤维素酶和半纤维素酶降解聚糖类以提供真菌生 长所需的营养物，然后才降解木质素。木质素通过木质素降 解酶降解在很大程度上是一种氧化过程。
细菌在初级代谢阶段降解木质素，在生长的对数期和稳 定期合成木质素降解酶［22］。白腐菌主要是在次生代谢期间 产木质素降解酶。影响木质素降解酶合成的主要因素有碳 源、氮源、培养基的 pH、微量元素、诱导剂和表面活性剂以及 培养条件如氧、温度、转速等。 4． 1 碳源和氮源 微生物种类不同，菌株产木质素降解酶 所需的最适碳源和氮源及其浓度和 C / N 也不同。李翠珍等 筛选出 1 株白腐真菌 F2，并对其产木质素降解酶特性进行了 研究，结果表明，限碳有利于 F2 产 LiP，但对 F2 产 MnP 的影 响不是很明显，限氮条件和富氮条件都有利于 F2 产 MnP，处 于中间浓度的氮源却不利于 F2 产 MnP［23］。张晓昱等对 1 株 白腐菌 BP 降解不同木质纤维素基质特性进行了研究，结果 表明，白腐菌 BP 不能利用木质素为唯一碳源和能源，木质素 的修饰有利于白腐菌产降解酶［24］。一般认为黄孢原毛平革 菌在受氮、碳或硫营养限制时产生木质素降解酶，而且不产 漆酶。但有关文献报道，该菌在空气中振荡培养时可以在高 于氮限制的氮源浓度下产生少量木质素过氧化物酶，在氮浓 度限制下产生少量漆酶［25］。徐勇等对白构菌液体发酵合成 漆酶的培养条件进行了研究，结果表明，提高底物碳源的聚 合度和采用振荡培养有利于漆酶的合成［26］。 4． 2 微量元素 微生物产木质素降解酶所需微量元素主