蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：

（一）材料的预处理及细胞破碎

分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法

这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2. 渗透破碎法

这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3. 反复冻融法

生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4. 超声波法

使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二) 蛋白质的抽提

通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

（三）蛋白质粗制品的获得

选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：

1. 等电点沉淀法

不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2. 盐析法

不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。

3. 有机溶剂沉淀法

中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。

（四）样品的进一步分离纯化

用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。

卵清蛋白分离提取及纯化的具体试验步骤

一、实验目的与原理

鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中较不稳定。由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基配制纯化胰酶的亲和材料。二、材料与试剂：

1．材料：新鲜鸡蛋2只

2：仪器：抽滤瓶500－1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器 3：试剂： 10％TCA，用固体NaOH调调PH至1.05－1.10，需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M，PH8.0Tris-HCL缓冲液（每ml含0.34BAEE和 2.22mgCaCL2），50ml pH8.0,0.1M Tris-HCL缓冲液三、操作步骤

1，取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50ml，置于烧杯中，外用温水浴25℃－30℃，在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积得三氯乙酸－丙酮（1:2V/V），立即出现大量白色絮状沉淀，加完后最终PH约3.5，再继续搅拌30min，然后在4℃冰箱中放置过夜。

2,次日用布氏漏斗抽滤，得黄绿色清液。

3，边搅拌边加入4℃预冷的丙酮200ml沉淀蛋白，在4℃放置2h之后将上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于4000rpm离心5min，收集沉淀。 4，将沉淀溶于10ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4h，换水两次，再对碳酸钠缓冲液透析过夜，4000rpm离心10min ,去除不溶物。

抗菌蛋白分纯的步骤

准备试剂：异丙醇含0.3M盐酸胍的95%乙醇无水乙醇1%SDS。

操作步骤：

1.取沉淀DNA后剩余的上清，用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1ml TRIzol加1.5ml异丙醇，室温放置10分钟，2～8℃12000×g离心10分钟弃上清。

2.用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗涤液，室温放置20分钟，2～8℃7500×g离心5分钟，弃上清，重复两次。用2ml无水乙醇同样方法再洗一次。

3.真空抽干蛋白质沉淀5～10分钟，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃温浴使其完全溶解，不溶物2～8℃10000×g离心10分钟除去。分离得到的蛋白质样品可用于Western Blot 或-5至-20℃保存备用。

注意事项

1.蛋白质沉淀可保存在含0.3M盐酸胍的95%乙醇或无水乙醇中2～8℃一个月以上或-5至-20℃一年以上。

2.用0.1% SDS在2～8℃透析三次，10000×g离心10分钟取上清即可用于Western Blot。常见问题分析：得率低：

A.样品裂解或匀浆处理不彻底。

B.最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解。蛋白质降解：组织取出后没有马上处理或冷冻。电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分。

γ球蛋白分离，纯化,鉴定的方法（包括原理，步骤，预期结果，注意事项） [原理]

血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16％，100ml血清中约含1.2g左右。

首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI为7.2左右。因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的α－球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的γ－球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。因此随洗脱液流出的只有γ－球蛋白，从而使γ－球蛋白粗制品被纯化。其反应式如下：

用上述方法分离得到γ－球蛋白是否纯净，单一？可将纯化前后的γ－球蛋白进行电泳比较而鉴定之。

[操作]

1)盐析――中性盐沉淀：取正常人血清2.0ml于小试管中，加0.9％氯化钠溶液2.0ml，边

搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液乙4.0ml，混匀后于室温中放置10min，3000r／min 离心10min。小心倾去含有清蛋白的上清液，重复洗涤一次，于沉淀中加入0.0175mol ／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)0.5～1.Oml使之溶解。此液即为粗提的γ－球蛋白溶液。

2) (2)脱盐――凝胶柱层析①装柱

洗净的层析柱保持垂直位置，关闭出口，柱内留下约2.0ml洗脱液。一次性将疑胶从塑料接口加入层析柱内，打开柱底部出口，调节流速0.3ml/min。凝腔随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部，最后使凝胶床达20厘米高，床面上保持有洗脱液，操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液面并防止层析床内出现“纹路”。在凝胶表面可盖一园形滤纸，以免加入液体时冲起胶粒。

②上样与洗脱：可以在凝胶表面上加圆形尼龙滤布或滤纸使表面平整，小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上的缓冲液面刚好下降至凝胶床表面，关紧下端出口，用长滴管吸取盐析球蛋白溶液，小心缓慢加到凝胶床表面。打开下端出口，将流速控制在0.25ml/min使样品进入凝胶床内。关闭出口，小心加入少量0.0175mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.3)洗柱内壁。打开下端出口，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复三次，以洗净内壁上的样品溶液。然后可加入适量缓冲液开始洗脱。

加样开始应立即收集洗脱液。洗脱时接通蠕动泵，流速为0.5ml/min,用部分收集器收集，每管1ml。

③洗脱液中NH4+与蛋白质的检查：取比色板两个(其中一个为黑色背底)，按洗脱液的顺序每管取一滴，分别滴入比色板中，前者加20％磺基水杨酸溶液2滴，出现白色混浊或沉淀即示有蛋白质析出，由此可估计蛋白质在洗脱各管中的分布及浓度；于另一比色板中，加人奈氏试剂应用液l滴，以观察NH4+出现的情况。

合并球蛋白含量高的各管，混匀。除留少量作电泳鉴定外，其余用DEAE纤维素阴离子交换柱进一步纯化。

(3)纯化――DEAE纤维素阴离子交换层析：用DEAE纤维素装柱约8-10cm高度，并用0.0175mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.3)平衡，然后将脱盐后的球蛋白溶液缓慢加于DEAE纤维素阴离子交换柱上，用同一缓冲液洗脱、分管收集。用20％磺基水杨酸溶液检查蛋白质分