专题一 基因工程

2. 构建基因表达载体
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3. 将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法、显微注射法
4. 目的基因的检测与鉴定
检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：
练习：
已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉 素的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或 标记基因是什么？请设计实验、预期实验结果，并 得出相应的实验结论。
基础理论和技术发展催生了基因工程
早 期 基 础 理 论
1859年达尔文提出生物进化论
1900年孟德尔基因分离定律和自由组合定律的再度提出
1910年摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁互换定律
后 期 基 础 理 论
1944年艾弗里证明DNA是遗传物质 DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体
(能抗虫)
1.分子手术刀 ——限制酶
项 目
来源 种类及命名 作用特点 作用结果
内 容
主要来源于原核生物 现已从300微生物中分离出约4000种限制酶 属名头字母+种名头2字母
识别双链DNA分子中 特定核苷酸序列
切割特定序列中的 特定位点
专一性
限制酶作用的化学键
√
2.分子缝合针——DNA连接酶
A 不添加抗 生素 B 添加一定浓 度的四环素 C 添加一定浓度 的氨苄青霉素 D 添加一定浓度 的两种抗生素
A 不添加抗 生素
B 添加一定浓 度的四环素
A组 B组 C组 D组 预期一 预期二 预期三 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ － ＋ ＋ － －
C D 添加一定浓 添加一定浓度 的两种抗生素 度的氨苄青 霉素 结 论 既含有抗四环素基因 也含有抗氨苄青霉素基因 只含有抗四环素基因
③过程：
④优点
（2）基因枪法
（3）花粉管通道法
2、将目的基因导入动物细胞 ①方法：显微注射法 ②程序：
3、将目的基因导入微生物细胞
①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 ②方法：用Ca2+处理细胞
→感受态细胞
→表达载体与感受态细胞混合 →感受态细胞吸收DNA分子
四、目的基因的检测与鉴定
项目 种类 E.coli DNA连接酶
(比较 )
内容
只作用于
主要作用于
黏性 末端 平 末端
T4 DNA连接酶 对象
黏性
末端，还可作用于
DNA片段
作用
部位 结果
磷酸二酯键
通过形成新的磷酸二酯键，形成重组DNA
DNA连接酶连接重组DNA分子
AATTCCGTAG GGCATCTTAA
DNA1
CTTCATG AATTCCGTAG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGCATCTTAAGGGATT
体外包装 基因重组
与载体连接 导入受体菌中储存 基因组文库
转化细菌
（2）反转录法：cDNA的合成 某种生物的单链mRNA
mRNA
反转录酶
逆转录酶
单链互补DNA DNA聚合酶 双链cDNA片段 与载体连接 导入受体菌中储存
cDNA
基因重组
cDNA文库
（二）利用PCR技术扩增目的基因
聚合酶链式反应 1.概念：PCR全称为_______________，是一项 体外 特定DNA片段 在生物____复制___________的核酸合成技术。 2.原理：DNA复制
目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
编码蛋白质的结构基因 （一）目的基因主要是______________________。 （二）获取目的基因的常用方法有哪些? 1、从基因文库中获取 2、利用PCR技术扩增 3、人工合成
（一）从基因文库中直接获取
1.基因文库：概念见P9 2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类 种 类
1953年沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型
1958年梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制
转录
逆转录
翻译
1958年克里克等提出中心法则
1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的 遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明

1967年基因转移载体的发现
技 术 发 明


1970年工具酶的发现
载体怎样才能具有能连接不同目的基因的潜能呢？ ②具有多个限制酶切点，以便与外源基因插入其中；
目的基因怎样才能在受体细胞分裂时不被丢失从而稳定地存在于子细胞内， ③能够在宿主细胞中复制并稳定地保存； 同时获得更多所需要的产品呢？
目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？ ④具有特殊的标记基因，便于进行筛选；
（1）方法: 分子杂交
（2）过程: 用上述探针和转基因生物的mRNA杂交，若 出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA
3、检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法: 抗原抗体杂交
（二）鉴定
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
来自百度文库
小节: 基因工程的基本操作程序
1. 获取目的基因
从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术
相 原理 同 原料 点 条件
解旋 方式
DNA复制 碱基互补配对 四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化
不 场所 同 酶 点 结果
体外复制
热稳定的DNA聚合酶 大量的DNA片段
细胞核内
细胞内的DNA聚合酶 形成整个DNA分子
（三）人工合成的目的基因
4.用转基因的动物作器官移植的供体 1、供体动物： 猪
2、存在的难题： 免疫排斥 3、解决方法： 将供体基因组导入某种基因调
节因子，以抑制抗原决定基因 的表达，或设法除去抗原决定 基因，再结合克隆技术，培育 出没有免疫排斥反应的转基因 克隆猪器官。
三.基因工程药品异军突起
利用基因工程方法制造“工程菌”， 可高效率地生产出各种高质量、低成本的 药品。 工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得 到高效率表达的菌类细胞株系。 白细胞介素-2、 我国已生产的产品 干扰素、 乙肝疫苗等
种类
质粒
质粒、噬菌体和动植物病毒 存在于细菌及酵母菌等微生物中， 核DNA以外能自我复制的小型环状DNA分子
载体
小节：基因工程的原理
分子手术刀——限制性内切酶
三大工具
分子缝合针——DNA连接酶
分子运输车——运载体
练习：
如图，就下列与核酸相关酶的作用机理填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
获取目的基因（例如血清蛋白基因）
构建基因表达载体 （在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子） 显微注射导入哺乳动物受精卵中 形成胚胎
将胚胎送入母体动物 发育成转基因动物（只有在产下的雌性动 物个体中，转入的基因才能表达）
为什么乳腺能成为基因药物最理想 的表达场所呢？
1、乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环， 不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。 2、从乳汁中获取目的基因产物，产量高，易提纯， 表达的蛋白质已经过充分的修饰加工，具有稳定的 生物活性。 3、从乳汁中源源不断获得目的基因的产物的同时， 转基因动物又可无限繁殖。
原核绅胞基因结构示意图
不能转录为信 使RNA
非编码区 编码区
不能转录为信 使RNA
非编码区
与RNA聚合酶 结合位点
能转录为信使RNA
真核绅胞基因结构示意图
非编码区
编码区
非编码区
与RNA聚合酶 结合位点 外显子 内含子
培育转基因抗虫棉的简要过程
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
棉花细胞
(不能抗虫)
转基因抗虫棉
近20种，年产值达30亿
基因工程药品 —— 胰岛素
作用：胰岛素是治疗糖尿病的特效药。 传统生产方法： 主要从猪、牛等家畜 的胰腺中提取，每100kg胰腺只能提取4~5g 胰岛素。产量低，价格昂贵。 基因工程方法：1979年，科学家将动物 体内的胰岛素基因与大肠杆菌DNA分子重组， 并在大肠杆菌内实现了表达。
二、基因表达载体的构建
1.目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，
并且可以遗传给下一代，同时使目的 基因能够表达和发挥作用。
所需物质：
2.基因表达载体的组成：
复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因
三、将目的基因导入受体绅胞
稳定 表达 受体细胞内维持_____和_____的过程 将目的基因导入 植物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库
3.基因文库的目的
为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的 目的基因。
4.获取目的基因的根据： 见课本P9
5.基因文库的构建方法
基因组DNA
（1）直接分离法(鸟枪法)
提取某种生物的全部DNA 限制酶切 一定大小的DNA片段
只含有抗氨苄青霉素基因
既不含有抗四环素基因 也不含有抗氨苄青霉素基因
预期四
＋
－
－
－
一、植物基因工程硕果累累
转基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力 ,以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。
二、动物基因工程前景广阔
1.用于提高动物生长速度
2.用于改善畜产品的品质 3.用转基因的动物生产药物 乳腺生物 反应器
DNA2
重组DNA
由于切割后的载体和目的基因具有相同的末端，故重组DNA存在3 重组DNA一定是载体-目的基因连接吗？ 载体-载体 目的基因-目的基因 中可能连接。即 载体-目的基因 、 、 。
3.分子运输车——载体
项目 作用 具备 条件 内容
将外源基因送入受体细胞 ①对受体细胞无害 载体能对受体细胞有害吗？
3.条件： 模板DNA( 含有目的基因 )
四种脱氧核苷酸 (dNTP) 热稳定DNA聚合酶(Taq酶） 一对引物： 一对寡核苷酸序列：与目的基因 的起始段互补
4.前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这 一序列合成引物。
5.过程
a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板 氢键 在热作用下，_____断裂，形成___________ 单链DNA b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引 双链 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下， DNA链 合成与模板互补的________。
一、基因工程的概念
基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 变异类型 基本过程 结 果 DNA重组技术 生物体外 基因 DNA分子水平 基因重组 剪切 → 拼接→ 导入→ 表达 人类需要的新生物类型和产品
思考讨论
1.什么叫基因？ 2.基因、DNA、染色体 之间是怎样的关系？
3.遗传信息是如 何表达的？
（一）检测
1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了 目的基因 （1）方法: DNA分子杂交 （2）过程: ①首先取出转基因生物的基因组DNA ②用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等 作标记，以此做探针 ③使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出 杂交带，表明染色体已插入染色体DNA中
2、检测目的基因是否转录出了mRNA
1965年氨基酸测序和1977年DNA测序技术的发明 1972年DNA体外重组的实现 1973年重组DNA表达实验的成功 1980年第一例转基因动物和1983年第一例转基因 植物问世 1988年PCR技术的发明

一、基因工程的概念
按照人们的愿望，在DNA分子水平上进行严格 的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋 予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人 们需要的新的生物类型和生物产品。
1.反转录法：
以目的基因转录成的信 使RNA为模板，反转录成互 补的单链DNA，然后在酶的 作用下合成双链DNA，从而 获得所需的基因。 目的基因的mRNA 反转录 单链DNA(cDNA） 合成
双链DNA (即目的基因)
2.根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
结构基因 化学 蛋白质 mRNA的 的氨基 推测 核苷酸 推测 的核苷酸 合成 序列 酸序列 序列 目的 基因
b a
A.切断a处的酶为_______ ①
B.连接a处的酶为_______ ③④
C.切断b处的酶为_______ ②
D.连接b处的酶为_______ 无
基因工程基本操作的四个步骤
1 2 3 4
目的基因的获取 基因表达载体的构建
有了目的基因，我们才 能赋予一种生物以另一 种生物的遗传特性。 使目的基因在受体细胞 中稳定存在，并可进行 遗传、表达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定 表达，才能实现一种生 物的基因在另一种生物 中的转化。 才能确定目的基因是否 真正在受体细胞中稳定 遗传和正确表达。
受体细胞 （一）转化： 目的基因进入_________内，并且在
（二）方法
将目的基因导入 ——显微注射法 动物细胞
将目的基因导入 ——感受态细胞 微生物细胞
1、将目的基因导入植物细胞的方法：
（1）农杆菌转化法 ①农杆菌特点：
易感染双子叶植物和裸子植物，对大多 数单子叶植物没有感染能力。
②原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞， 并整合到受体细胞染色体的DNA上。