实验六 菠菜叶绿体分离与荧光观察 (1)

实验六
菠菜叶片叶绿体分离与荧光观察
实验目的
1、了解细胞器分离的一般原理，
掌握基本分离方法。 2、观察叶绿体自发荧光与间接荧
光
实验原理
细胞器的分离：
先匀浆→差速离心。
将组织匀浆后在等渗介质中差速离心， 是分离细胞器的常用方法。
实验原理
用低渗、超声破碎或研磨等匀浆方法可使细胞质 膜破损，形成细胞核、线粒体、叶绿体、内质 网、高尔基体、溶酶体等细胞器和细胞组分组 成的混合匀浆，再通过差速离心，可将各种亚 细胞组分和各种颗粒分开。
实验用品
1．器材
离心机、研钵、天平、显微镜、离心管、纱布、 烧杯、量筒、滴管、载玻片、盖玻片
2．材料
新鲜菠菜叶
3．试剂
0.35mol/L氯化钠溶液 （等渗介质）
实验步骤 一、叶绿体的分离与观察
1、菠菜及实验用器皿放入0-4℃预冷。 2、取新嫩菠菜叶，洗净擦干、去粗脉，称10g，放入 研钵。 3、加入0.35mol/L氯化钠溶液20ml，快速研磨（3060s）。 4、将匀浆用4层纱布过滤。 5、将滤液装入2支离心管，经天平上平衡后，放入离心 机中，1000r/min离心２min，去上清，沉淀即为叶绿 体。 6、加0.35mol/L氯化钠溶液2ml，悬浮沉淀。 7、取叶绿体悬液１滴于载玻片上，加盖片。 8、普通光镜下观察，荧光显微镜下演示叶绿体的直接 荧光。
实验原理
差速离心：即利用不同的离心速度所产生的不同离心力， 分离各种亚细胞组分和各种颗粒。 在一定的离心场中，同一时间内，密度、大小不同的颗粒 其沉降速度不同，依次增加离心力和离心时间，密度及大 小不同的颗粒会先后分批沉降在离心管底部，分批收集即 可获得各种亚细胞组分。 颗粒在离心场中，其沉降速度取决于其大小、形状和密度，
也与离心力ຫໍສະໝຸດ Baidu介质黏度有关。
Differential centrifugation 沉降顺序：核——线粒体——溶酶 体与过氧化物酶体——内质网与高 尔基体——核蛋白体。
High speed
Low speed
实验原理
自发荧光：细胞内含有的某些天然物质，
经短波光照射后所发出的光。
诱发荧光：物体经荧光染料染色后，再 经短波光照射所发出的荧光。
注意事项：
实验步骤
二、叶绿体的间接荧光观察
取叶绿体悬液１滴于载玻片上， 滴加1滴0.01%吖啶橙，染色10min， 加盖片，荧光显微镜观察叶绿体 的间接荧光。 注意事项：
思考题
P110 第3题：
叶绿体分离实验的原理是什么？ 在分离叶绿体时应注意什么问题？