再生障碍性贫血

再生障碍性贫血
一、前沿学术概述
传统观念认为，再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）（再障）是一组化学、物理、生物因素或原因不明所致的骨髓造血功能衰竭症。

这是一个以形态学为基础的概念，诊断主要依据血象和骨髓象改变，是个综合征。

既往根据“种子（造血干祖细胞）、土壤（造血微环境）、虫子（异常免疫）”假说和W/W v、Sl/Sl d动物模型及放化疗导致的造血功能衰竭现象，认为再障是一个异质性疾病，是综合征。

该“综合征”涵盖了众多骨髓造血功能衰竭症，是多病共有的“症”，而非独立的疾病体系。

目前国内外对再障的认识较传统观念有显著进步：①确定骨髓造血功能衰竭综合征不等同于AA，AA只是其中的一种；②明确了AA 是T淋巴细胞功能亢进而介导的以造血器官——骨髓为靶器官的自身免疫性疾病；③免役抑制治疗可以治愈AA[1-3]。

AA概念一旦被明确，不仅利于AA的正确诊断与治疗，而且使得AA发病机制研究及对其他骨髓造血功能衰竭症的认识均有极大帮助。

1 大量的研究结果均提示细胞免疫尤其是T淋巴细胞量和功能的变化在再障发病中起关键作用。

① 再障患者的T淋巴细胞增多、T淋巴细胞亚型比例失常及功能亢进。

再障患者体内T淋巴细胞亚群比例失调，表达激活标志，如CD25、HLA-DR、CD56、CD57的T淋巴细胞显著高于对照，且骨髓中的比例高于外周血。

免疫抑制治疗后，这些活化细胞数量下降。

②致敏T淋巴细胞为寡克隆性。

如果认为再障是T淋巴细胞介导的以骨髓为靶器官的自身免疫性疾病，那么，在骨髓中应可以看到T淋巴细胞克隆性增生。

用RT-PCR法检测发现AA患者Vβ基因中Vβ3、Vβ20、Vβ21、Vβ22表达率增高，且每例CDR3均有1－2个占优势的不同的J基因重组，表明AA
患者的多克隆T淋巴细胞已被高度增生的寡克隆淋巴细胞代替。

③再障患者T淋巴细胞和淋巴细胞因子的造血抑制与促造血细胞凋亡的作用。

免疫抑制治疗前AA的CD8+细胞可以抑制BFU-E、CFU-GM形成。

AA患者T淋巴细胞在体外不经预先刺激即可自发分泌IFN-γ，刺激后分泌IFN-γ、TNF-α的T淋巴细胞较正常对照组增多，培养上清中的IFN-γ、TNF-α的水平也增高。

重型再障（SAA）骨髓标本中可检测到IFN-γ mRNA，而健康对照、其它慢性贫血需经常输血者、化疗后全血细胞减少及MDS患者BMMNC均无IFN-γ mRNA表达。

IFN-γ、TNF-α均可以诱导CD34+细胞表达Fas抗原，其所介导的对骨髓造血细胞免疫攻击，不仅仅是简单的造血抑制作用，而且是对造血祖细胞的直接破坏。

实际上，在再障患者的骨髓CD34+细胞也确实高表达Fas抗原。

内生性造血抑制因子（如IFN-γ）在造血干祖细胞旁近作用时，很低水平就能够起到显著效应。

还有其他抑制因子亦起一定作用，如部分再障患者血清中有MIP-1α水平升高。

④Th1/Th2失衡及DC1亚群失调
虽然过去长期认为CD8+淋巴细胞(CTL)在再障的发病中起重要作用，但近来研究提示CD4+细胞（Th细胞）也有着重要作用。

对AA患者骨髓细胞进行T细胞克隆培养，均为CD4+细胞，可抑制BFU-E、CFU-GM 的形成，能直接攻击自身或异体的CD34+细胞。

去除SAA患者BMMNC中的CD4+细胞，可以增加BFU-E、CFU-E及CFU-GM的集落形成。

而且，在SAA患者HLA确定的易感基因也均是HLAII类分子，而HLAII类分子介导的是CD4+T淋巴细胞的活化。

AA患者外周血单个核细胞及骨髓中Th1细胞(CD4+IFN-γ＋细胞)数量增加，Th1/Th2显著升高。

Th1细胞的效应细胞和效应因子——CD3+CD8+细胞、TNF-α均与网织红细胞、中性粒细胞绝对值呈负相关。

Th1细胞则与TNF-α、CD3+CD8+细胞正相关，与网织红细胞
（Ret）、中性粒细胞绝对值(ANC)负相关关系。

而IL-4、Th1细胞/Th2细胞比值平衡与Ret、ANC呈正相关关系[4-6]。

SAA患者骨髓中不仅摄取、加工自身抗原的功能不成熟DC1——CD1a+CD11c+细胞增加了，同时有免疫原性的，可以充分激活Th0细胞向Th1细胞分化的成熟DC1——CD83+CD11c+细胞数量也在增加，而且成熟DC1增加得尤为显著，表明SAA患者骨髓中整个DC1细胞处于功能亢进状态，患者的免疫耐受已被打破。

至恢复期，SAA患者的CD1a+CD11c+细胞、CD83+CD11c+细胞分别显著下降，CD83+CD11c+／CD1a+CD11c+比例平衡也开始恢复，与正常对照组已无统计学差异，表明恢复期SAA患者的免疫耐受在逐步建立[7]。

Th1细胞、CD3＋CD8+细胞是CD83+CD11c+细胞下游的效应细胞，研究发现，CD83+CD11c+细胞与Th1细胞、CD3＋CD8+细胞正相关，与Ret、ANC负相关，提示CD83+CD11c+细胞在SAA的发病中有重要作用。

⑤CD28超家族共刺激分子及CD4+调节性T细胞（CD4+Treg）
那么，在AA中DC又是如何活化Th0细胞向Th1偏移而导致Th细胞失衡呢？
研究发现，AA患者骨髓中CD28表达量(CD4+CD28+)、CD28+/CTLA-4+及CD28+/PD-1+细胞比值均显著增加；CTLA-4表达减少。

AA患者骨髓CD4+T细胞表面ICOS 表达量与对照组无明显变化，AA患者CD28+/CTLA-4+细胞、CD28+/PD-1+细胞比值较对照组明显升高，说明在AA发病期，正性调控共刺激分子表达增加，而负性调控共刺激因子表达未相应增加，正负性调控共刺激分子平衡失调，免疫平衡发生偏移，从而致异常免疫应答持续增强。

Pearson直线相关分析进行研究发现：CD28+/CTLA-4+与Th1/Th2呈正相关关系。

ANC与CD4+CD28+呈负相关，与CD4+CTLA-4+T细胞数呈正相关关系。

研究发现，AA患者骨髓CD4+CD25+Treg细胞、CD4+IL-10+细胞数较对照组无统计
学差异，但CD4+TGF-β1+细胞较正常对照组有所减少，而免疫抑制治疗后恢复期CD4+CD25+Treg细胞、CD4+IL-10+细胞数显著增加。

ICOS及PD-1的表达与CD4+CD25+Treg细胞数呈正相关关系，提示：①这两种共刺激分子可能与CD4+CD25+Treg抑制功能有关，②ICOS可能作为负调控因素参与AA发病。

从造血的微环境角度来看，发病期骨髓CD4+T细胞胞浆中各种细胞因子水平与对照组比较，IFN-γ+/IL-4+、IFN-γ+/TGF-β+及IFN-γ+/IL-10+细胞比值较对照组明显增加，提示AA发病期细胞因子格局向Th1型偏移。

至恢复期，IFN-γ+/IL-4+、IFN-γ+/TGF-β+及IFN -γ+/IL-10+比值较发病期明显下降，与对照组无统计学差异，表明AA经IST进入恢复期后，Th1型细胞因子分泌下降，细胞因子分泌格局向Th2型和Treg转化[8]。

综上，AA免疫发病机制可总结为：在抗原刺激下，使DC细胞功能亢进，CD4T细胞激活性共刺激分子增高，调节性共刺激分子及细胞下降导致免疫格局向Th1偏移，细胞免
疫激活，引起造血功能衰竭。

2如何治疗难治性SAA
对于ATG治疗后难治性的SAA目前尚无统一的治疗方案。

儿童和成人患者分别在1疗程或2疗程ATG免疫抑制治疗后施行异基因造血干细胞移植[9]。

年轻患者移植后存活率达70%左右，但对岁数偏高患者来说，仍是一个挑战。

从获得临床资料看，异基因造血干细胞移植总体数量较少，随访时间亦不够长，预处理方案也还在进一步完善中。

第2疗程的ATG治疗，有效率在22%至64%，与各家的病例选择和治疗的年代不同有关（支持治疗条件不一致）。

意大利报告的有效率达77%，而NIH的结果仅30%左右，发生区别的主要原因之一就是NIH的难治性AA标准严于意大利[10]。

前1疗程免疫抑制治疗部分有效患者可能对第3疗程治疗起反应。

50%患者对高剂量CTX起反应[11]。

其他如抗CD52单抗、氟达拉滨、雷帕霉素等有治疗成功的报道，但尚在临床探索中。

3无关供者骨髓移植治疗SAA现状
无关供者异基因骨髓移植适用于没有HLA相合同胞供者，且免疫抑制治疗失败的SAA 患者。

根据既往大系列的回顾性分析，由于移植物排斥、GVHD和感染，上世纪90年代前无关供者异基因骨髓移植的SAA长期存活率约为30%～40%。

但目前随着：①预处理方案
改进，避免全剂量放疗，使用低强度预处理；②DNA高分辨技术应用，供受体相合度更高（包括HLA-C位点相合）；③支持治疗持续进步；无关供体骨髓生存率已达70%左右。

参考文献
1.邵宗鸿,杨天楹. 重视原发性造血功能衰竭症的鉴别. 中华血液学杂志2001, 22：509-510.
2.何广胜, 邵宗鸿, 刘鸿等. 50例长期存活的重型再生障碍性贫血患者的随访. 中华血液学杂志, 2002, 23: 229-232.
3.Young NS, Calado RT, Scheinberg P. Current concepts in the pathophysiology and treatment of aplastic anemia. Blood, 2006, 108:2509-2519.
4.何广胜,邵宗鸿, 和虹等. 重型再生障碍性贫血骨髓中Th细胞亚群数量及功能的变化. 中华血液学杂志, 2004,25:613-616.
5.Dufour C, Corcione A, Svahn J, et al. Interferon gamma and tumour necrosis factor alpha are overexpressed in bone marrow T lymphocytes from paediatric patients with aplastic anaemia. Br J Haematol 2001,115: 1023-1031.
6.Sloand E, Kim S, Maciejewski JP, et al. Intracellular interferon-gamma in circulating and marrow T cells detected by flow cytometry and the response to immunosuppressive therapy in patients with aplastic anemia. Blood, 2002,100: 1185-1191.
7.何广胜,邵宗鸿, 和虹等. 重型再生障碍性贫血患者骨髓Ⅰ型树突状细胞亚群的变化. 中华血液学杂志, 2004,25:649-652.
8.Guangsheng He, Lin Zhou, Depei Wu, et al. CD4+Treg in immune pathophysiology of aplastic anemia. Blood, 2006, 108: 16b.
9.Bacigalupo A, Locatelli F, Lanino E, et al. Fludarabine, cyclophosphamide and anti-thymocyte globulin for alternative donor transplantations in acquired severe aplastic anemia: a report from the EBMT-SAA Working Party. BMT, 2005, 36: 947-950.
10.Scheinberg P, Nunez O, Young NS. Retreatment with rabbit anti-thymocyte globulin and ciclosporin for patients with relapsed or refractory severe aplastic anemia. Br J Haematol, 2006, 133: 622-627.
11.Brodsky RA, Sensenbrener LL, Smith BD, et al. Durable treatment-free remission after high dose cyclophosphamidetherapy for previously severe aplastic anemia. Ann Interm Med, 2001, 135: 477-483.
二、临床问题
1重型再障（SAA）的免疫抑制治疗（IST）方案现状如何？
ATG/ALG+CsA仍然是SAA一线免疫抑制治疗方案，一般在用药后3～6月起效，个别可早或晚，反应规律是输血间期延长、脱离输血至骨髓造血恢复、血象恢复，总有效率80%左右。

肾上腺糖皮质激素早期曾广泛用于SAA治疗，但效果不如ATG/ALG+CsA，且并发症较多，如Cushing氏综合征、高血压及股骨头坏死等，现已很少使用。

大剂量静脉免疫球蛋白（HDIVIG）主要用于肝炎相关性再障及合并严重感染的SAA，其疗效不如ATG/ALG+CsA，但免疫抑制较轻，且有抗感染作用，对于不能耐受ATG/ALG+CsA的患者是个选择。

CTX始于上世纪六十年代，九十年代美国学者又有报道。

CTX免疫抑制作用强，但骨髓抑制亦深，需要强烈的支持治疗，NIH进行的ATG/ALG+CsA与HD-CTX前瞻性随机对照
研究发现，HDCTX的临床总住院经济花费超过ATG/ALG+CsA。

美国NIH、英国医学会的AA治疗指南及Lancet杂志均持明确反对意见。

2再障免疫发病机制在临床中有何应用意义
现行的SAA疗效标准，尤其是治愈、停药多是以临床输血、血象改善情况为主，这不含有对自身反应性T淋巴细胞状态和自身免疫耐受重建的指标。

这也涉及到对IST方案疗效的评价，不能准确判断IST有或无效的时点。

目前SAA的治疗中一线使用的ATG/ALG、CSA等药物在体内能代谢较长一段时间，存在着后效应，如ATG输注后1个月体内持续的血药溶度，在体外还可直接促进再障骨髓中CD34+细胞的CFU-GM和BFU-E形成。

在IST 治疗早期，可能还未显效，若此时根据临床输血和血象改变指标评价，会断定此IST方案无效而换治疗方案，这无疑影响了治疗和疗效评定。

Glukman等曾对94例SAA患者组织了多中心前瞻性ALG和CsA对照治疗研究，3个月无效患者接受对照方案治疗，3个月有效率CsA组高于了ALG组，1年有效率（含接受对照方案治疗者）二者相当，该对照研究中两组患者接受对照治疗过早，不能完全确定为单药治疗的疗效。

减停药物时，若仅依据输血、血象指标则导致了很高的复发率，实际上多数患者对再次的IST仍有效，提示复发是IST疗程不足所致。

对恢复期SAA患者研究发现，根据正常对照组结果所做的95％可信限范围，依照现行的疗效标准，部分Th1细胞/Th2细胞比值、DC比值未正常的SAA患者已达基本治愈，这说明防止T淋巴细胞再激活和重建免疫耐受会较造血恢复滞后一些。

因此，仅以临床症状和血象的改善为指标作为减停药的指标是不够的，应含有有关T淋巴细胞再激活和自身免疫耐受重建的指标。

3如何选择同胞异基因骨髓移植治疗SAA？
对于一个初诊SAA患者，标准治疗方案就是行HLA相合的同胞异基因骨髓移植或ATG/ALG+CSA的强化IST。

欧洲SAA工作组Cox风险分析模型研究发现年龄和中性粒细
胞数在决定选择BMT还是IST中有重要作用。

患者可分三类：（1）宜行BMT者：儿童，无论其中性粒细胞数多少；成人患者应<40岁，且中性粒细胞≤0.3×109/L；（2）宜行IIST 者：成人患者，年龄>40岁者；（3）BMT/IIST均可：年龄10-40间，且中性粒细胞> 0.3×109/L。

根据DNA高分辨结果进行HLA-I类、II类抗原，包括HLA-C全相合的无关供者骨髓移植，其长期生存率优于IST。

由于寻找到无关供者需要较长时间，使之不能成为SAA治疗的一线方案，但随着目前HLA配型技术进展，应在IST无效后及早行无关供者骨髓移植。

在无关供者异基因骨髓移植中使用ATG+CTX作为预处理方案的效果并不佳。

EBMT 目前推荐使用低剂量CTX（300mg/m2×4）+Fludarabine 30mg/m2×4 + ATG 3.75mg/kg×4，并常规加用CSA+MTX预防排斥和GVHD。

也有研究以Campath （anti-CD52）代替ATG进行预处理的研究，以低剂量TBI（300cGy）+ CTX （50mg/kg/d×4）+ Campath-1H（0.2mg/kg/d×4）或以Campath-1H（0.2mg/kg/d×5-儿童，20mg/kg/d×5-成人）+CTX（10-20mg/kg/d×4或300mg/m2×4）+ Fludarabine （30/m2×4-5）。

4 哪些因素影响无关供者骨髓移植治疗SAA的疗效
年龄：年龄偏大者预后差，20岁以下者生存时间显得更长些；性别：同性别移植后的生存率高于不同性别移植生存率，男供女时，移植物排斥增加，女供男时，重度GVHD发生率上升；行移植的时间：在诊断一年内行移植的患者生存率高于诊断一年以上移植者；预处理方案：不使用放疗的儿童患者生长发育及生育能力正常，第二肿瘤的发生率亦低；运用含Campth-1H的预处理移植病例中，病毒感染如CMV和腺病毒感染的危险性增加。

推荐阅读文献：
1.邵宗鸿,杨天楹. 重视原发性造血功能衰竭症的鉴别. 中华血液学杂志2001, 22：
509-510.
系统地总结近年来关于造血功能衰竭症的研究进展，讲述了造血功能衰竭症的分类及鉴别诊断的方法。

2.Young NS, Calado RT, Scheinberg P. Current concepts in the pathophysiology
and treatment of aplastic anemia. Blood, 2006, 108:2509-2519.
此为最新的关于再障免疫发病机制和免疫抑制治疗的权威综述，综合了半世纪来再障研究的成果，涵盖病因学、流行病学、免疫学、分子生物学及临床循证医学等内容。

3.Baciglupo A, Brand R, Oneto R, et al. Treatment of acquired severe aplastic
anemia: Bone marrow transplantation compared woth immunosuppressive therapy-The European Group for Blood and Marrow Transplantation experience. Semin Hematol, 2000, 37:69-80.
系统阐述了SAA治疗中IST及骨髓移植的地位，分析了各自的优缺点，探讨了选择方法，至今仍被广泛采用。

4.Marsh JCW. Management of acquired aplastic anemia. Blood Rew, 2005,
19:143-151.
全面总结了AA目前治疗的方法，包括IST和骨髓移植（同胞及无关供者），叙述很详细，从适应症、选择方法、具体治疗方案药物、并发症至长期生存率及复发率。

何广胜孙爱宁。