土壤微生物量碳氮的测定

土壤微生物量的测定

一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取－碳自动分析法）

1、试剂配制

（1）去乙醇氯仿制备：市售氯仿一般含有少量乙醇作为稳定剂，所以，使用前必须将其中的乙醇去掉。方法是量取适量的分析纯氯仿，按1 2（v : v）的比例与蒸馏水或去离子水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。注意：氯仿具有致癌作用，所有操作必须在通风橱中进行。

（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1mol L-1]

（3）硫酸钾浸提剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：取1742.6 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末装，倒于25L塑料桶中，加蒸馏水至20L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1），溶解24 h。

（4）六偏磷酸钠溶液（5%，pH2.0）：50.0g分析纯六偏磷酸钠溶于800ml双蒸水，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，再用双蒸水定容至1L。注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制，且由于其易粘于烧杯底部，加热时常因受热不均使烧杯破裂。

（5）过硫酸钾溶液（2%）：20.0g分析纯过硫酸钾溶于双蒸水，定容至1L。注意：过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放，使用期最多为7d。

（6）磷酸溶液（21%）：37ml 85%分析纯浓磷酸与188ml双蒸水混合。

（7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前先经105℃烘2～3h），溶于双蒸水，定容至1L。

2、仪器设备

碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。

3、操作步骤

（1）土壤前处理

新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土壤中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2mm）并混匀。如果土壤过湿，应在室内适当风干，并经常翻动，以避免局部干燥，至土壤含水量约为田间持水量（Water-holding capacity，WHC）的40%（以手感湿润疏松但不结块为宜）。如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节含水量至田间持水量的40%。将土壤置于密封的塑料桶内，在25℃下预培养7～15d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1mol L-1 NaOH溶液以吸收土壤呼吸产生的CO2。这些过程是为了消除土壤水分限制对微生物的影响，以及植物残体对测定的干扰。经预培养的土壤应立即分析，否则，应置于4℃下保存，但分析前需在上述条件下至少再培养24h。

（2）熏蒸

称取经前处理相当于50.0g烘干基的新鲜土壤3份，置于80ml烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，同时放入盛有去乙醇氯仿（约2/3烧杯）的烧杯2～3个，烧杯内放入少量经浓盐酸溶液浸泡过夜后洗涤烘干的瓷片（0.5mm大小，防瀑沸），或放入抗瀑沸的颗粒，同时放入一小烧杯稀NaOH溶液以吸收熏蒸期间释放出来的CO2，干燥器底部还应加入少量水以保持湿度。用熏蒸抽真空装置（也可采用无油真空泵，如DOA-P181-BN型真空/正压泵）抽真空，在–0.07MPa真空度下使氯仿剧烈沸腾3～5min。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下熏蒸24h。打开干燥器阀门时，由于空气进入应该有明显的声音；否则，意味着抽真空不够或漏气，应重新进行熏蒸。

取出土壤和氯仿（氯仿到回贮存瓶，可再使用），将装土壤的烧杯转入清洁真空干燥器，同上反复抽真空（–0.07MPa）直到土壤无氯仿味为止；否则，残留在土壤中的氯仿将影响分析结果。一般需要反复抽真空5～6次，每次3min，每次抽真空后，最好完全打开干燥器，以加快去氯仿速度和效果。熏蒸的同时，另称取等量的土壤3份，置于另一干燥器中，除不加入去乙醇氯仿进行熏蒸外，其他操作与熏蒸土壤一样，作为“对照”土壤。

（3）浸提

将熏蒸土壤无损地转移到200ml聚乙烯塑料瓶中，加入100ml 0.5mol L-1 K2SO4，土水比为1 : 4（w : v），振荡（25℃，300r min-1）浸提30min，用中速定量滤纸过滤于125ml塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份不熏蒸土壤于200ml聚乙烯浸提塑料瓶中，加入100ml 0.5mol L-1 K2SO4同上浸提。同时做3个不加土壤的试剂空白。浸提液应立即分析，或在–18℃下保存。（4）测定

取10 ml土壤浸提液于40ml样品瓶中（注意解冻的浸提液在取样前应彻底混匀），加入10ml 六偏磷酸钠溶液（pH2.0），使浸提液中的沉淀（CaSO4和K2SO4）全部溶解。采用碳–自动分析仪（Phoenix 8000）测定样液有机碳含量。基本过程：先在样液中通入高纯度氮气5～10min，以除去溶解在浸提液中的部分CO2，样液再进入无机碳排除管进一步去掉残留的CO2，然后样液进入紫外氧化管，在紫外灯以及过硫酸钾溶液和磷酸溶液的作用下，浸提液中的有机碳全部氧化为CO2并释放出来，产生的CO2经一系列纯化后通过红外检测器测定。载气为高纯度氮气。详细操作步骤参见仪器使用说明。

工作曲线：分别吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml浓度为1000mg C L-1邻苯二甲酸氢钾标准溶液于100ml容量瓶中，用双蒸水定容。即得0、20、40、60、80、100mg C L-1系列标准碳溶液。分别吸取上述不同浓度的标准碳溶液10ml于40ml样品瓶中，按上述相同方法测定。

（5）结果计算

土壤微生物生物量碳：B C = E C / k EC

式中：E C = 熏蒸土壤浸提的有机碳–不熏蒸土壤浸提的有机碳；

k EC为转换系数，取值0.45（Wu等，1990）。

二、土壤微生物生物量氮（氯仿熏蒸－K2SO4提取－碳自动分析法）

1、试剂配制

（1）去乙醇氯仿：同上