云南兰科植物菌根内生真菌种类研究2006

上 ,待菌丝长满树叶后 ,放入广口瓶内 ,瓶底事先 铺上保湿的海绵 , 再加上湿润滤纸 , 注意经常加 水 ,保持滤纸的湿度 ,分别用黑光灯 、散射光 、室温 和低温交替培养 ,重复 3 次. 待长出子实体再进行 鉴定. 2. 4 内生菌根真菌的鉴定
按常规形态鉴定方法.
3 结果与分析
3. 1 分离试验结果 自云南省主产兰科植物的 8个地区 11个品种
丝核菌属 2
R h izocton ia (在兰 科 植 物 中 寄 生 的 特有种 )
3
11 MLX102,MLX114
CLN114 , ML Y106
MLY107, CLN115
CLN116, CLN103
CLN108 , MLX113
CLB113
4
3
CLX111 , MLX112
SHY113
气生菌丝白色絮状 ,菌丝末端常变形呈念珠状 ,无锁状联合 ; 无分 生孢子 ;经诱导未产生子实体
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第 3期 伍建榕等 :云½南ö兰¹科©植Æ物À菌¹À根¡内£生真菌种类研究
7
表 2 不同种类及产地兰花内生真菌代表菌株的鉴定情况
序 菌株数 号 /个
菌株号
主 要 特 征
挑取少量菌丝于 PDA 培养基平板中央 ,每菌
3 收稿日期 : 2006 - 03 - 28 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30371190). 作者简介 :伍建榕 (1963 - ) ,女 ,福建清流人 ,博士 ,副教授 ,主要从事森林病理学及资源微生物利用的教学与研究.
6
西 南 林 学 院 学 报 第 26卷
菌落边缘不规则 ,气生菌丝浅黄色至黄色 ,菌落表面有墨绿色的子囊 壳 ,子囊壳球形 ,四周有毛 ,膜质 ;子囊棒状 ;子囊孢子橄榄形 ,单细胞
兰科丝核菌类 (O rchida2 ceous rhizoctonias) ,包括 角菌 根 菌 属 ( Ceratorh i2 za) , 瘤 菌根菌 属 ( Epu2 lorh iza) 和 念 珠 菌 根 菌 属 (M on iliopsis)等 毛壳菌属
丝核菌属 1 R h izocton ia
2
8 MLX104,MLY105
SHX104, SHX105
CLB112, CLB128
CLB129, CLD120
菌落极薄呈细菌状 ;气生菌丝白色 ,菌丝分枝呈直角或锐角 ,分枝 处有较明显缢缩 ,不远处有隔膜 ,无锁状联合 ;无分生孢子 ;经诱导未 产生子实体
株重复 3皿 , 25 ℃恒温培养. 用解剖镜仔细观察菌 落形态 (形状 、大小 、边缘 、正背面颜色 、色素 ) ,显 微镜观察菌丝形态 (有无分隔 、缢缩 、有无锁状联 合 )及有无子实体产生 、孢子形态 、大小等及拍照 并记录结果. 2. 3 子实体的培养
在 PDA 培养基上常规培养不产生孢子的菌株 用下列方法诱导子实体.
总菌株数 /个 20 15 24 20 15 15 15 15 15 15 7 8 1
表 1 不同产地和种类的兰花获得菌株情况
代表菌株数 /个 7 11 8 5 4
代表菌株
CLD111, CLD112, CLD115, CLD117, CLD118, CLD119, CLD120 CLN103, CLN108, CLN110, CLN111, CLN113, CLN114, CLN115, CLN116, CLN129, CLN130, CLN112 CLB111, CLB110, CLB112, CLB113, CLB119, CLB128, CLB129, CLB130 CLX110, CLX112, CLX113, CLX114, CLX117 HLS101, HLS104, HLS111, HLS112
图 1 内生菌根真菌各属的分离频率
4 结 论
(1) 丝核菌属 1,丝核菌属 2 (在兰科植物中寄生 的特有种 )为兰科丝核菌类 ,小菌核属为半知菌亚门 (Deuteromycotina)无孢目 (Agonomycetales)无孢科的 真菌 ;木霉属、单端孢属、青霉属、枝顶孢属为半知菌 亚门 (Deuteromycotina)丛梗孢目 (Moniliales)淡色孢 科 (Moniliaceae)的真菌 ;异孢迭球孢霉属半知菌亚门 (Deuteromycotina) 丛 梗 孢 目 (Moniliales) 暗 色 孢 科 (Dematiaceae)的真菌 ;M enispora、Em bellisia、团丝核菌 属、Endophragm ia、Gliom astix m urorum、无孢菌群属半 知菌亚门 (Deuteromycotina)丝孢纲 (Hyphomycetes)的 真菌 ;镰刀菌属为半知菌亚门 (Deuteromycotina)丛梗 孢目 (Moniliales)瘤座孢科 (Tuberculariaceae)的真菌 ; 毛壳菌属为子囊菌亚门 (A scomycotina) 球壳菌目 (Sphaeriales)毛壳菌科的真菌 ;小姑属为担子菌亚门 (Basidiomycotina)口蘑科 (Tricholomataceae)的真菌.
(1. 西南林学院 保护生物学学院 ,云南 昆明 650224; 2. 南京林业大学 森林资源与环境学院 ,江苏 南京 210037; 3. 云南农业大学 植物病理重点实验室 ,云南 昆明 650201)
摘要 :从云南省兰科植物主产区的 8个地区 11个品种 89株兰科植物的营养根上分离获得真 菌菌株 184个 ,其中出现频率较高或文献曾报道为兰科内生菌根真菌的有 65个. 根据菌落形 态 、菌丝特征 、产孢结构 、孢子形态及子实体诱导等大致分为 18类 ,分别隶属于丝核菌属 、兰科 丝核菌类 、毛壳菌属 、木霉属 、镰刀菌属 、顶枝孢 、束格孢属 、团丝核菌属 、T richosporiella sp. 、Gli2 om astix m u rorum、兰小姑 、微囊菌属 、Ca tenu la ria piceae、丝孢纲的其他属等.
第 26卷 第 3期
西 南 林 学 院 学 报
2006年 6月 JOURNAL OF SOUTHW EST FORESTRY COLLEGE
Vo1. 26 No. 3 Jun. 2006
云南兰科植物菌根内生真菌种类研究 3
伍建榕 1 , 韩素芬 2 ,朱有勇 3 ,吕 梅 1 ,王光平 2 , 郭文林 1
1 试验材料
1. 1 分离材料 原生地野生状态下兰科植物的老根及新鲜营
养根. 1. 2 分离真菌所用培养基
PDA 培养基 :去皮的马铃薯 200 g切成 1 cm3的 小块加入适量水煮沸 ,煮沸开始计时 30 m in,将其 滤液加入琼脂 14 g、葡萄糖 20 g,加水保持至 1 L ,加 热融化 ,分装 ,于 121 ℃下 30 m in备用.
鉴定结果
1
8
CLN110, CLN111
MLX103 , MLX105
Leabharlann Baidu
CLN113, CLB119
CLB111, KW 214
气生菌丝浅褐至深褐色 ,菌丝分枝处有较明显缢缩 ,不远处有隔 膜 ,菌丝体多为直角分枝 ;有表面深褐色或浅褐色 、内部深褐色的菌 核 ,菌核间有菌丝相连 ,菌核颗粒状 ,细丝与基物相连. 无分生孢子
5
MLX103 , MLX105 , MLX113 , MLX108 , MLX111
5
ML Y105 , ML Y106 , ML Y107 , ML Y111 , ML Y114
7
MLX107 , MLX102 , MLX104 , MLX103 , MLX114 , MLX111 , MLX112
89株兰科植物的根上共分离获得真菌菌株 185 个 ,其中出现频率较高或文献曾报道可能是兰科 内生真菌的 65个菌株作为代表菌株 ,见表 1.
兰花品种
春兰 1 春兰 2 春兰 2 春兰 3 春兰 4 虎头兰 墨兰 1 墨兰 2 墨兰 3 兜兰 齿瓣石斛 长距石斛 卡特兰
产地
大理 怒江 保山 下关 思茅 西双版纳 元江 思茅 文山 西双版纳 元江 元江 云南
木霉属 ( T richoderm a)
6
4
SHY114, CLD118
CLD119, CLD117
2 试验方法
2. 1 菌根真菌的分离 自根尖取新鲜营养根的根段 ,长 4 ～5 cm ,清
水冲洗 根 上 的 泥 沙 后 用 75% 的 乙 醇 处 理 20 ～ 30 s, 0. 1%的升汞溶液中浸泡 5 ～10 m in (浸泡时 间视组织材料的大小而定 ) , 对材料表面进行灭 菌 ,无菌水冲洗 4～5次 ,在无菌培养皿中横切成 3 ～5 mm的薄片 ,置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中 (含有 100μg / g氯霉素的 PDA ) ,切面朝向培养基 , 每皿放 3～4块组织 , 25 ℃恒温避光培养. 经过 3～ 7 d菌丝体从组织块上长出并形成一定大小菌落 , 以组织块为中心向周围扩散生长的为分离的目的 菌种 ,即从其边缘挑取菌丝体移到另一 PDA 平板 , 重复至获得纯培养物 ,转入 PDA 斜面保存. 2. 2 各菌株形态及培养形状观察
关键词 :兰科植物 ;菌根 ;内生菌 ;云南
中图分类号 : S718 文献标识码 : A 文章编号 : 1003 - 7179 (2006) 03 - 0005 - 06
兰科植物是一类观赏价值和经济价值极高的 珍贵花卉和药材 ,目前多采用组培方法进行繁殖. 但移栽无菌苗生长缓慢 ,甚至于不开花 ,长势明显 劣于原生地自然状态下生长的兰科植物. 其原因 是兰科植物需要与菌根真菌共生才能生长良好 , 无菌组培苗不能形成内生菌根. 自 Bernard发现自 然界中几乎所有的兰科植物都与真菌共生形成菌 根 ,对兰科内生真菌的研究已有 100 年的历史. 成 年兰科植物与真菌共生形成内生菌根是自然界的 一种普遍现象 ,菌根真菌为兰科植物提供生长 、繁 殖所必需的营养物质. 为此 ,笔者对云南保山 、怒 江贡山 、大理 、西双版纳等地的兰科植物进行内生 菌根真菌的分离 ,为解决兰科植物这类珍贵花卉 的人工栽培提供理论依据和可用菌根菌种类.
(1) 在培养基上诱导子实体 :将菌株的培养 物接种于上述 5种子实体诱导培养基 ,分别用黑光 灯 、散射光 、室温和低温交替培养 ,重复 3次.
(2) 在壳斗科栎树叶上诱导子实体 :将壳斗 科的栎叶洗净晾干 ,剪成碎片 ,装入三角瓶 121 ℃ 灭菌 45 m in,冷却后将菌株的培养物接种在栎叶
( Chaetom ium )
5
3
SHX107, SHX111
CLN129
菌丝平铺于培养基上迅速生长 ,菌落质地较稀疏 ,白色 ,薄绒状 ,后 期在表面呈环纹状或簇状产生绿色 、墨绿色或黄绿色的分生孢子堆. 培养基背面变为黄色或黄绿色. 分生孢子梗细长 、无色 ,产孢瓶体在 小分枝上常对生或轮生 ,分生孢子淡色 ,浅黄绿色 ,球形 ,多聚生于产 孢瓶体口部
2
DLW109, DLW 113
6
SHX104, SHX105, SHX107, SHX111, SHX113, SHX115
2
SHY102, SHY108
2
SHY113, SHY114
1
KW 214
3. 2 性状观察与子实体诱导结果 65个代表菌株可初步分为 18类 , 18类内生真
菌的鉴定采用 Hawksworth提出的分类系统. 内生 菌根真菌各属 (类 )的分离频率见图 1;内生菌根真 菌代表菌株的鉴定结果 [ 3 - 8 ]见表 2.
1. 3 诱导子实体的培养基 [ 1 ] 燕麦培养基 ( g /L ) ;玉米培养基 ( g /L ) ;马铃薯
葡萄糖蛋白胨琼脂培养基 ( g /L ) ;燕麦汁蛋白胨琼 脂培养基 ( g /L ) ; AC 培养基 ( g /L ) ;诱导子实体的 壳斗科植物 ,如麻栎 (Q uercus acu tissim a ) 、栓皮栎 及槲栎的叶.