第八章污染生态学一般研究方法
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■因此，在缺乏组氨酸的培养基上，只存少数自发回变菌落生 长，而能诱发细菌回变的致突变物可使细菌生长增多，从 而可判断被药物是否具有致实变性。 31
实验数据的综合分析技术
■数据整理与方差分析 ■回归和相关分析技术 ■主成分分析 ■聚类分析 ■数学建模
32
谢 谢！
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test in mice）
30
细菌回复突变试验（Ames试验）
■利用鼠伤寒沙门氏菌突变株，即组氨酸缺陷型，其原始菌株 菌体内的组氨酸是通过自身一系列酶催化反应合成的，这 种能自身合成所需营养成份的菌株叫做野生型菌株。
■本试验用鼠伤寒沙门氏菌为突变株，其不能合成组氨酸，而 必须由外界提供这种菌珠被称为营养缺陷式营养实变型 （his-）。当诱变剂作用于菌株后，在菌株遗传物质的特 定位点发生基因回复突变成为野生型（his+）。
▲慢性毒性试验是指机体长期接触环境污染物的毒 性效应试验，一般暴露时间为6个月至2年，甚至
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剂量－效应关系和剂量－反应
关系曲线图
100
100
50
50
死亡率（％）
反应强度（％）
剂量 图 1剂量－反应曲线（直线型）
剂量 图2 剂量－反应曲线（抛物线型）
死亡率（概率单位 ）
源自文库
死亡率（％）
100
100
50
50
■荧光原位杂交技术
■ DNA损伤试验
■基因芯片技术
15
单链构象多态性分析（SSCP）
■单链DNA在中性条件下会形成二级结构。这种二 级结构依赖于其碱基的序列。即使只有一个碱基 的不同，也会形成不同的二级结构并可引起非变 性条件下的电泳迁移率的差异。
■技术路线：PCR产物95C变性5分钟，立即置冰上。 10%聚 丙 烯 酰 胺凝 胶 电泳 。 条件 ： 电泳 缓 冲 液 0.5TBE，电压70v, 4C环境下电泳过夜（0.2%硝 酸银染色）。
18
19
20
实验方法：1.探针及标本的变性
■探针变性： ■标本变性：
21
2.杂交
■ DNA探针10µL滴于已变性并脱水的玻
片标本上，盖上18×18盖玻片，用 Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂 交过夜（约15～17h）。
22
3.洗脱
23
4.杂交信号的放大
24
5.封片
■可采用不同类型的封片液。如果封片液
的相互关系，还需要借助分子生物学、细胞生物 学、遗传学、生物化学、生理学、景观生态学、 全球生态学等的研究方法。
14
四、新技术的运用
（一）生化和分子水平研究
■一般代谢酶的活性测定
▲乙酰胆碱酯酶
▲三磷酸腺苷酶
■解毒系统酶类诱导作用的检测
▲混合功能加氧酶
▲谷胱苷肽硫转移酶
■抗氧化防御系统检测
■ PCR-SSCP（聚合酶链式反应-单链构象多态性） 技术
▲与SAM不同的是通过加入来自生态系统浸出液 提供给微宇宙中生物群落所需的基质。
11
（三）微宇宙试验
■室外水生微宇宙（Outdoor Aquatic Microcosm） 又称中宇宙（Mesocosm），试验单元6 m3，试验生物包 括浮游植物、浮游动物、鱼类、大型水生植物和无脊 椎动物。
■土壤核心微宇宙（Soil Core Microcosm，SCM ） 该法采用野外环境的土壤核心，将其设置在环境条件控 制的实验室中，试验生物因土壤核心采集场所不同而 不同，可研究化学物质和营养元素对农业生态环境的 影响及其环境归趋。
mutation assay）
■哺乳动物细胞基因突变试验（mammalian cell
gene mutation assay）
■染色体畸变试验（chromosome aberration test） ■微核试验（micronucleus, MN） ■显性致死试验（dominant lethal） ■小鼠精子畸形试验（sperm shape abnormality
FISH（荧光原位杂交）: 荧光标记21号染色体探针，与外周血或
绒毛、羊水细胞进行原位杂交，患者细胞出 现三个荧光信号。
核型报告：
正常男性核型： 46，XY 正常女性核型：46，XX Down综合征： 47，XX（XY），+21
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（二）环境因素“三致”作用的研究技术
■细菌回复突变试验（bacterial reverse
先天愚形(21三体综合征，Down syndrome)
发病率1/600～800 新生儿
主要临床特征： 严重智力低下，生长迟缓 枕骨扁平，发际低 眼距宽，外眼角上斜，内眦赘皮 鼻根低平，舌大，腭弓高尖 通贯手，小指内弯，有一指褶纹 男性不育、女性偶有生育能力
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21q22.2 BAC克隆在Down综合征间期细胞中的杂交信号
污染生态学
Pollution ecology
第八章 污染生态学的一般研究方法
（Chapter 8: General Methods for Pollution Ecology Research ）
主讲：环境科学与工程学院 王宏镔 2012年12月14日
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讲授内容
一、野外调查 二、受控实验
（一）体内研究——整体生物试验 （二）体外研究——器官、细胞和亚细胞水平 试验 三、多学科交叉 四、新技术的运用 （一）生化和分子水平研究 （二）环境因素“三致”作用的研究技术 （三）微宇宙试验
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荧光原位杂交技术
■荧光原位杂交技术（fluorescence in situ
Hybridization, FISH）问世于70年代后期， 其原理是标记了荧光的单链DNA（探针） 和与其互补的DNA（玻片上的标本）退火 杂交，通过观察荧光信号在染色体上的位置 来反映相应基因的情况。
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荧光原位杂交技术
■模拟农田生态系统（Modeling agricultural ecosystem） 该系统模拟农田条件，无陆生动物，为同时测定农药在 土壤、植物、水溶液和空气中的残留而设计，采用 0.75 m3的矩形玻璃室，可打入足够数量的空气，通 过玻璃室模拟微风并能收集挥发的农药。
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生态环境样品实验室技术
对数剂量
对数剂量
图3 剂量－反应曲线（S形线型）
图4 剂量－反应曲线
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（二）体外研究——器官、细胞 和亚细胞水平试验
■器官灌流技术； ■单细胞悬液； ■细胞分离技术； ■生物离心技术。
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（三）微宇宙试验
■微宇宙法（microcosm）是研究污染物在生
物种群、群落、生态系统和生物圈水平上 生物效应的一种方法，又被称为模型生态 系统法（model ecosystem）。
生态环境样品采集技术 土壤样品采集技术 水样品采集技术 大气样品采集技术 生物样品采集技术
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二、受控实验
■受控实验是在模拟自然生态系统的受控生
态实验系统中研究单项或多项因子相互作 用及其对种群或群落影响的方法技术（郑 师章等，1994）。
■由于野外干扰因素多，生物对污染的反应
是对综合环境条件的反应，要探索单一污 染物或污染物之间对生物的联合作用，在 实验室内需要进行添加外源污染物的受控 实验。
中不含有Mowiol（可使封片液产生自封 闭作用），为防止盖片与载片之间的溶 液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。 封好的玻片标本可以在-20～-70的冰箱 中的暗盒中保持数月之久。
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荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）
26
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常染色体病
▲用于在实验室测定有毒物质在多物种水平对淡 水生态系统的影响。
▲试验时间64天，容器为4L的玻璃广口瓶，试验 生物包括10种藻、4种无脊椎动物、1种细菌。 对温度、光照强度、pH值等理化参数均有具体 要求。
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（三）微宇宙试验
■烧杯水生微宇宙（Mixed Flask Culture， MFC）
▲又称烧杯混合培养，试验时间12～14周，容器 为1L的玻璃广口瓶，试验生物包括4种藻、2 种无脊椎动物、一些细菌和原生动物。对温度、 光照强度、pH值等理化参数均有具体要求。
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二、受控实验
（一）体内研究——整体生物试验
■根据暴露时间的长短可分为急性、亚慢性（亚急
性）和慢性毒性试验。
▲急性毒性试验是研究化学物等有害因子大剂量一 次暴露或24h内多次暴露对所试生物引起的毒性试 验。
▲亚慢性（亚急性）毒性试验是指机体连续多日接 触环境污染物的毒性效应试验，一般暴露时间为 1-3月。
■ DNA变性：
当溶液中的DNA分子处于高温或高pH值(13) 条件下，维持双螺旋在一起的碱基互补对就被破 坏，DNA双链解离成两条单链，这一过程叫DNA 变性。
■ DNA复性：
当温度降低至合适温度或恢复pH值至中性， 两条裂解的单链按碱基互补配对原则重新形成双 链结构，这一过程叫DNA复性，又叫DNA杂交。
■微宇宙是自然生态系统的一部分，包括有
生物和非生物的组织及其过程，能提供自 然生态系统的群落结构和功能。
■微宇宙不完全等于自然生态系统，没有自
然生态系统庞大和复杂，不能包含自然生 态系统的所有组成。
9
（三）微宇宙试验
■标准化水生微宇宙（Standardized Aquatic
Microcosm，SAM）
■植物样品分析技术 ■动物样品分析技术 ■微生物样品分析技术 ■环境样品分析技术
13
三、多学科交叉
■生态学和环境科学等学科的研究方法均可借鉴到
污染生态学的研究中 。
■在实际研究过程中，经常要借助化学、土壤学、
物理化学、植物学、动物学、微生物学、地理学、 水文学、气象学等学科的研究手段。
■为了更进一步研究微观和宏观层次下生物与环境
2
一、野外调查
■野外调查是真实获得生物与污染环境相互
关系第一手资料的关键步骤。
■能否采集到有代表性的样本是野外调查的
关键 。
■在开展野外调查前，需要精心做好准备。 ■采样的记录根据调查目的而定，但要完整，
所记载的参数要全面。
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一、野外调查
野外观测研究技术 自然环境观测技术 小气候观测技术 生物环境观测技术 野外实验设计技术
实验数据的综合分析技术
■数据整理与方差分析 ■回归和相关分析技术 ■主成分分析 ■聚类分析 ■数学建模
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谢 谢！
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test in mice）
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细菌回复突变试验（Ames试验）
■利用鼠伤寒沙门氏菌突变株，即组氨酸缺陷型，其原始菌株 菌体内的组氨酸是通过自身一系列酶催化反应合成的，这 种能自身合成所需营养成份的菌株叫做野生型菌株。
■本试验用鼠伤寒沙门氏菌为突变株，其不能合成组氨酸，而 必须由外界提供这种菌珠被称为营养缺陷式营养实变型 （his-）。当诱变剂作用于菌株后，在菌株遗传物质的特 定位点发生基因回复突变成为野生型（his+）。
▲慢性毒性试验是指机体长期接触环境污染物的毒 性效应试验，一般暴露时间为6个月至2年，甚至
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剂量－效应关系和剂量－反应
关系曲线图
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死亡率（％）
反应强度（％）
剂量 图 1剂量－反应曲线（直线型）
剂量 图2 剂量－反应曲线（抛物线型）
死亡率（概率单位 ）
源自文库
死亡率（％）
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■荧光原位杂交技术
■ DNA损伤试验
■基因芯片技术
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单链构象多态性分析（SSCP）
■单链DNA在中性条件下会形成二级结构。这种二 级结构依赖于其碱基的序列。即使只有一个碱基 的不同，也会形成不同的二级结构并可引起非变 性条件下的电泳迁移率的差异。
■技术路线：PCR产物95C变性5分钟，立即置冰上。 10%聚 丙 烯 酰 胺凝 胶 电泳 。 条件 ： 电泳 缓 冲 液 0.5TBE，电压70v, 4C环境下电泳过夜（0.2%硝 酸银染色）。
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实验方法：1.探针及标本的变性
■探针变性： ■标本变性：
21
2.杂交
■ DNA探针10µL滴于已变性并脱水的玻
片标本上，盖上18×18盖玻片，用 Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂 交过夜（约15～17h）。
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3.洗脱
23
4.杂交信号的放大
24
5.封片
■可采用不同类型的封片液。如果封片液
的相互关系，还需要借助分子生物学、细胞生物 学、遗传学、生物化学、生理学、景观生态学、 全球生态学等的研究方法。
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四、新技术的运用
（一）生化和分子水平研究
■一般代谢酶的活性测定
▲乙酰胆碱酯酶
▲三磷酸腺苷酶
■解毒系统酶类诱导作用的检测
▲混合功能加氧酶
▲谷胱苷肽硫转移酶
■抗氧化防御系统检测
■ PCR-SSCP（聚合酶链式反应-单链构象多态性） 技术
▲与SAM不同的是通过加入来自生态系统浸出液 提供给微宇宙中生物群落所需的基质。
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（三）微宇宙试验
■室外水生微宇宙（Outdoor Aquatic Microcosm） 又称中宇宙（Mesocosm），试验单元6 m3，试验生物包 括浮游植物、浮游动物、鱼类、大型水生植物和无脊 椎动物。
■土壤核心微宇宙（Soil Core Microcosm，SCM ） 该法采用野外环境的土壤核心，将其设置在环境条件控 制的实验室中，试验生物因土壤核心采集场所不同而 不同，可研究化学物质和营养元素对农业生态环境的 影响及其环境归趋。
mutation assay）
■哺乳动物细胞基因突变试验（mammalian cell
gene mutation assay）
■染色体畸变试验（chromosome aberration test） ■微核试验（micronucleus, MN） ■显性致死试验（dominant lethal） ■小鼠精子畸形试验（sperm shape abnormality
FISH（荧光原位杂交）: 荧光标记21号染色体探针，与外周血或
绒毛、羊水细胞进行原位杂交，患者细胞出 现三个荧光信号。
核型报告：
正常男性核型： 46，XY 正常女性核型：46，XX Down综合征： 47，XX（XY），+21
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（二）环境因素“三致”作用的研究技术
■细菌回复突变试验（bacterial reverse
先天愚形(21三体综合征，Down syndrome)
发病率1/600～800 新生儿
主要临床特征： 严重智力低下，生长迟缓 枕骨扁平，发际低 眼距宽，外眼角上斜，内眦赘皮 鼻根低平，舌大，腭弓高尖 通贯手，小指内弯，有一指褶纹 男性不育、女性偶有生育能力
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21q22.2 BAC克隆在Down综合征间期细胞中的杂交信号
污染生态学
Pollution ecology
第八章 污染生态学的一般研究方法
（Chapter 8: General Methods for Pollution Ecology Research ）
主讲：环境科学与工程学院 王宏镔 2012年12月14日
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讲授内容
一、野外调查 二、受控实验
（一）体内研究——整体生物试验 （二）体外研究——器官、细胞和亚细胞水平 试验 三、多学科交叉 四、新技术的运用 （一）生化和分子水平研究 （二）环境因素“三致”作用的研究技术 （三）微宇宙试验
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荧光原位杂交技术
■荧光原位杂交技术（fluorescence in situ
Hybridization, FISH）问世于70年代后期， 其原理是标记了荧光的单链DNA（探针） 和与其互补的DNA（玻片上的标本）退火 杂交，通过观察荧光信号在染色体上的位置 来反映相应基因的情况。
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荧光原位杂交技术
■模拟农田生态系统（Modeling agricultural ecosystem） 该系统模拟农田条件，无陆生动物，为同时测定农药在 土壤、植物、水溶液和空气中的残留而设计，采用 0.75 m3的矩形玻璃室，可打入足够数量的空气，通 过玻璃室模拟微风并能收集挥发的农药。
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生态环境样品实验室技术
对数剂量
对数剂量
图3 剂量－反应曲线（S形线型）
图4 剂量－反应曲线
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（二）体外研究——器官、细胞 和亚细胞水平试验
■器官灌流技术； ■单细胞悬液； ■细胞分离技术； ■生物离心技术。
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（三）微宇宙试验
■微宇宙法（microcosm）是研究污染物在生
物种群、群落、生态系统和生物圈水平上 生物效应的一种方法，又被称为模型生态 系统法（model ecosystem）。
生态环境样品采集技术 土壤样品采集技术 水样品采集技术 大气样品采集技术 生物样品采集技术
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二、受控实验
■受控实验是在模拟自然生态系统的受控生
态实验系统中研究单项或多项因子相互作 用及其对种群或群落影响的方法技术（郑 师章等，1994）。
■由于野外干扰因素多，生物对污染的反应
是对综合环境条件的反应，要探索单一污 染物或污染物之间对生物的联合作用，在 实验室内需要进行添加外源污染物的受控 实验。
中不含有Mowiol（可使封片液产生自封 闭作用），为防止盖片与载片之间的溶 液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。 封好的玻片标本可以在-20～-70的冰箱 中的暗盒中保持数月之久。
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荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）
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常染色体病
▲用于在实验室测定有毒物质在多物种水平对淡 水生态系统的影响。
▲试验时间64天，容器为4L的玻璃广口瓶，试验 生物包括10种藻、4种无脊椎动物、1种细菌。 对温度、光照强度、pH值等理化参数均有具体 要求。
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（三）微宇宙试验
■烧杯水生微宇宙（Mixed Flask Culture， MFC）
▲又称烧杯混合培养，试验时间12～14周，容器 为1L的玻璃广口瓶，试验生物包括4种藻、2 种无脊椎动物、一些细菌和原生动物。对温度、 光照强度、pH值等理化参数均有具体要求。
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二、受控实验
（一）体内研究——整体生物试验
■根据暴露时间的长短可分为急性、亚慢性（亚急
性）和慢性毒性试验。
▲急性毒性试验是研究化学物等有害因子大剂量一 次暴露或24h内多次暴露对所试生物引起的毒性试 验。
▲亚慢性（亚急性）毒性试验是指机体连续多日接 触环境污染物的毒性效应试验，一般暴露时间为 1-3月。
■ DNA变性：
当溶液中的DNA分子处于高温或高pH值(13) 条件下，维持双螺旋在一起的碱基互补对就被破 坏，DNA双链解离成两条单链，这一过程叫DNA 变性。
■ DNA复性：
当温度降低至合适温度或恢复pH值至中性， 两条裂解的单链按碱基互补配对原则重新形成双 链结构，这一过程叫DNA复性，又叫DNA杂交。
■微宇宙是自然生态系统的一部分，包括有
生物和非生物的组织及其过程，能提供自 然生态系统的群落结构和功能。
■微宇宙不完全等于自然生态系统，没有自
然生态系统庞大和复杂，不能包含自然生 态系统的所有组成。
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（三）微宇宙试验
■标准化水生微宇宙（Standardized Aquatic
Microcosm，SAM）
■植物样品分析技术 ■动物样品分析技术 ■微生物样品分析技术 ■环境样品分析技术
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三、多学科交叉
■生态学和环境科学等学科的研究方法均可借鉴到
污染生态学的研究中 。
■在实际研究过程中，经常要借助化学、土壤学、
物理化学、植物学、动物学、微生物学、地理学、 水文学、气象学等学科的研究手段。
■为了更进一步研究微观和宏观层次下生物与环境
2
一、野外调查
■野外调查是真实获得生物与污染环境相互
关系第一手资料的关键步骤。
■能否采集到有代表性的样本是野外调查的
关键 。
■在开展野外调查前，需要精心做好准备。 ■采样的记录根据调查目的而定，但要完整，
所记载的参数要全面。
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一、野外调查
野外观测研究技术 自然环境观测技术 小气候观测技术 生物环境观测技术 野外实验设计技术