蛋白质的分离与纯化

• 吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以 解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一 表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的 分子之间可以建立动态平衡，源自文库为吸附平衡。
• 吸附层析过程就是不断地产生平衡和不平衡、吸 附与解吸的动态平衡过程。
• 实验中常用的固体吸附剂有氧化铝、硅 酸镁、磷酸钙、氢氧化钙、活性钙、蔗 糖、纤维素和淀粉。
48
5
Sephadex G-150
中粗 超细
40-120 10-40
15±1.5 20-30 5000-400000 1000-150000
72
5
Sephadex 中粗 G-200 超细
40-120 10-40
20±2.0 30-40 5000-800000 1000-200000
72
5
最大流体 静力压/Pa (cmH2O) >9810(100) >9810(100)
• 在分配层析中，固定相是极性溶剂（例如水、 稀硫酸、甲醇等）。此类溶剂能和多孔的支持 物(常用的是吸附力小、反应性弱的惰性物质 如淀粉、纤维素粉，滤纸等)紧密结合，使呈 不流动状态；流动相则是非极性的有机溶剂。
• 分配系数(α)是指在一定温度和压力条 件下达到平衡，物质在固定相和流动相 两部分的浓度比值。
1、凝胶层析的特点及应用
• 特点：设备简单、操作方便、样品 回收率高、实验重复性好、特别是 不改变样品生物学活性等优点。
• 用途：蛋白质(包括酶)、核酸、多糖 等生物分子的分离纯化，同时还应 用于蛋白质分子量的测定、脱盐、 样品浓缩等。
2、凝胶层析的原理
凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶 颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。
▪ 离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质， 分子中含有可解离的基团。
▪ 含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂， 可解离出H+；
▪ 含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂， 可解离出OH-。
1.离子交换层析的原理
生物大分子如蛋白质、核酸等多价电解质有不 同的分子大小及电荷排列方式。
当在一定pH下净电荷为负的蛋白质分子可通过 静电键结合到带正电荷的阴离子交换剂上；
>9810(100)
>9810(100)
4905(50) 3434(35) 1472(15) 981(10)
4. 层析柱的重要参数
• ⑴柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从 柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色 谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因 引柱体积又称“床”体积，常用Vt 表示。 ⑵外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙， 这部分体积称外水体积，亦称间隙体积， 常用Vo表示。
3. 凝胶的种类和性质
(1)交联葡聚糖凝胶（Sephadex) 1) Sephadex G G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。 G 反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。 2） SephadeX LH—20，是Sephadex G—25的羧丙基衍生物，溶于 水和亲脂性溶剂，用于分离不溶于水的物质。
当在一定pH下净电荷为正的蛋白质分子可通 过静电键结合到带负电荷的阳离子交换剂上；
大分子依其与离子交换剂亲和力的不同，而在 以不同牢度被吸附于离子交换剂，通过改变离子 强度或(和)pH使大分子再从离子交换剂上先后 被洗脱下来。
2. 离子交换层析的应用
1)水处理 离子交换层析是一种简单而有效的杂质及各
概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装
有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进 行分离的技术。
原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合
物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶 孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗 脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶 孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后 被洗脱出来。
• 常用的洗脱液有乙烷、苯乙醚、氯仿， 以及乙醇、丙酮或水与有机溶剂形成的 各种混合物。
• 吸附层析通常用于分离脂类、类固醇类、 类胡罗卜素、叶绿素以及它们的前体等 非极性和极性不强的有机物。
（五）分配层析 (partition chromatography)
• 分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配 系数不同而达到分离目的的层析技术，相当于 一种连续性的溶剂抽提方法。
种离子的方法，聚丙乙烯树脂广泛的应用于高纯 水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。 2)分离纯化小分子物质
离子交换层析广泛应用于无机离子、有机酸、 核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯 化。例如对氨基酸的分析使用强酸性阳离子聚苯 乙烯树脂，将氨基酸混合液在pH值为2～3上柱。 这时氨基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗脱液 的离子强度和pH值，这样各种氨基酸将以不同的 速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。全自动氨 基酸分析仪就是采用这种原理制成。
的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计
算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点 （或半高处）。
洗脱体积
5. 凝胶过滤在试验室中的应用
1）生物大分子物质的分离纯化 2）分子量的测定 3）分级分离 4）溶液浓缩 5）平衡常数的测定 6）细胞及颗粒的分离
6. 分子量的测定
▪ 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子
• 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。
• 1944年出现纸层析。
• 以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高 压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析 等。
（一）层析的分类
• 按层析的分离机理分类
• 排阻层析(exclusion chromatography) • 离子交换层析(ion exchange chromatography) • 吸附层析(absorption chromatography) • 分配层析(partition chromatography) • 亲和层析(affinity chromatography) • 金属螯合层析(metal chelating chromatography) • 疏水层析(hydrophobic chromatography) • 反向层析(reverse phase chromatography) • 聚焦层析(focusing chromatography) • 灌注层析(perfusion chromatography)
品名
Sephadex G-1O Sephadex G-15
葡聚糖凝胶(Sephadex )的物理特性
干胶颗粒 直径/μm
得水值 Wf/g.g-1
床体积 /mL.g-1
最适分段分离范围
球蛋白分 线性葡聚糖 子质量／Da 分子质量/Da
溶胀所需 时间/h
20℃
lOO ℃
40-120 1.0±0.1 2-3
（六）亲和层析
(Affinity Chromatography)
• 许多物质都具有和某化合物发生特异性 可逆结合的特性。例如：酶与辅酶或酶 与底物（产物或竞争性抑制剂等），抗 原与抗体，凝集素与受体，维生素与结 合蛋白，凝集素与多糖（或糖蛋白、细 胞表面受体），核酸与互补链（或组蛋 白、核酸多聚酶、结合蛋白）以及细胞 与细胞表面特异蛋白（或凝集素）等。
5.0±0.3
9-11
1500-30000
500-10000
6
2
超细 10-40
Sephadex G-75
中粗 超细
40-120 10-40
7.5±0.5 12-15
3000-70000
1000-50000
24
3
Sephdex G-100
中粗 40-120 超细 10-40
10±l.0 15-20 4000-150000 1000-100000
（四）吸附层析 (absorption chromatography)
• 吸附作用是指某些物质能够从溶液中将溶质浓 集在其表面的现象。
• 利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团， 对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对 不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方 法，称之为吸附层析。
• 固定相为固体，流动相为液体。
(2)琼脂糖凝胶（Sepharose ; pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad) 依靠糖链之间的次级键维持网状结构，琼脂糖密度越大，网状结
构越密集。 (3)聚丙烯酰胺
一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联 而成。交联剂越多，孔隙度越小。 商品名为生物胶—P（Bio-Gel P). (4) 聚丙乙烯凝胶（Styrogel) 大网孔结构。
第九节
蛋白质 的分离与纯化
一、 引言
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理
三、蛋白质（酶）分离 与纯化
四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
四、层析技术
• 层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家 Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶 子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素 以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开， 由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。
3)分离纯化生物大分子物质
离子交换层析是依据物质的带电性质的不 同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生 物大分子的一种重要手段。
由于生物样品的复杂性，一般很难只经过 一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其 它分离方法结合使用。
使用离子交换层析分离样品要充分利用其 按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条 件，通过离子交换层析可以得到较满意的分离 效果。
分配系数（α）
＝
物质在固定相中的浓度 物质在流动相中的浓度
• 在层析过程中，当有机溶剂流动相流经样品点 时，样品中的溶质便按其分配系数部分地转入 流动相向前移动。当经过前方固定相时，流动 相中的溶质就会进行分配，一部分进入固定相。 通过这样不断进行的流动和再分配，溶质沿着 流动方向不断前进。各种溶质由于分配系数不 同，向前移动的速度也各不相同。分配系数较 大的物质，由于分配在固定相多些，分配在流 动相少些，溶质移动较慢；而分配系数较小的 物质，流动速度较快。从而将分配系数不同的 物质分离开来。
1. 亲和层析的原理
• 亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物 质可逆性特异结合的化合物（称配体）连接到 某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装 柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时， 此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而 留在柱上，其他物质则被冲洗出去。然后再用 适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗 脱下来，从而达到分离提纯的目的 。
（二）排阻层析 （凝胶层析）
凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行层 析分离的方法，均称之为排阻层析。
用于层析的分离介质称为排阻层析介质。 凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯
酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。 目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药 在研究和生产中必不可少的分离介质。
• 物质之所以能在固体表面停留，这是因为固体表 面的分子和固体内部分子所受的吸引力不同。在 固体内部，分子之间互相作用的力是对称的，其 力场互相抵消。而处于固体表明的分子所收的力 是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作 用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或 溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余 力的影响，就会被吸引而停留下来。
• ⑶内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内 部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙 的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。 不包括固体支持物的体积（Vg）。 ⑷峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需 洗脱液的体积，常用Ve 表示。
• 当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可 以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置 所用洗脱液体积为Ve。 当样品体积与洗脱体积 比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积
700
700
3
1
40-120 1.5±0.2 2.5-3.5
1500
1500
3
1
粗 100-300
Sephadex 中粗
G-25
细
50-150 20-80
2.5±0.2
4-6
1000-5000
100-5000
6
2
超细 10-40
粗 100-300
Sephadex G-50
中粗 细
50-150 20-80
量有关: LogM=k1-k2V（e Ve为洗脱体积）
Log M
LogM 测
A B
C
先测得几种标准蛋白质的 Ve，并以其分子量对数对 Ve作图得一直线，再测出 待测样品的Ve，查标准曲 线即可确定分子量。
V测
（三）离子交换层析
• 根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲 和力不同而达到分离的目的。