第二章蛋白质样品的制备
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亮抑酶肽（leupetin），它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含 DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸 和半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂A（pepstatin A），抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑蛋白酶肽 （aprotinin），抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素 (bestatin),抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价 格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱 中，其中胃蛋白酶抑制剂A在PH=9的时候不能抑制蛋白酶。
⑸ 甲苯磺酰赖氨酸甲酮（TLCK），甲苯磺 酰
苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）
通常浓度在0.1-0.15mmol/L，这些相同的成分 不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。
蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些 蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。
（一）温和的裂解方法
通常应用于组分比较简单的样品，例如组织 培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分 析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、 完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合 起来应用。
求为止。
3. 裂解液裂解
含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜，使细胞内容物释放出来。 应用对象：组织培养细胞 操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行
悬浮处理。
4.酶裂解
有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解。 应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。 操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。
ห้องสมุดไป่ตู้
⑴ PMSF(苯甲基磺酰氟）
是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/L, 灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是 其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现 加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（DTT）或者 β-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减小， 因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。
二、剧烈的蛋白裂解
常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞， 或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方 法可以使细胞完全破碎裂解。
1. 超声裂解法
超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细 胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。 应用对象：悬浮细胞 操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，
样品处理应在冰浴中进行。
第二章 蛋白质样品的制备
蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一
步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样 品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究 的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的 蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和 物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具 有难度的。
样品制备的原则
于结实的管子里。每克细胞（湿重） 加入1-3克玻璃珠，剧烈震荡1min， 冰浴1min。重复上述步骤。
三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解
当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这会 严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。 如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低 温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备。 另外，许多组织蛋白酶在PH超过9.0的时候会失 活，因此在样品裂解液中出现Tris、碳酸钠和载 体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这些 方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述条 件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要应用 蛋白酶抑制剂。
白。
第一节 样品破碎与分离蛋白质
一、样品的类型
1.整体样品 是生物个体小的物种（如微生物），可以整体 取样。
2.组织样品 有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。
3.细胞样品 包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长 的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细 胞）和从组织中分离同类的细胞样品。
1. 渗透裂解
非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级 应用对象： 血细胞、组织培养细胞。 操作步骤： 将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶
胀而释放出细胞内容物。
2. 冻融裂解
许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解 应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。 操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要
⑵ AEBSF
为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/L， 作用与PMSF相似，但溶解性较好，且毒性低。 但
是AEBSF可能会改变蛋白的等电点。
⑶ 金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（EDTA）
乙二醇双四乙酸（EGTA）
通常应用1mmol/L的工作浓度，通过螯合自由的金属离 子来抑制金属蛋白酶活性。
⑷ 肽蛋白酶抑制剂
磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。
4. 机械匀浆法
使用匀浆器破碎细胞或组织 应用对象：固体组织，如心脏、肝
脏、肾脏组织和细胞悬 液。 操作步骤：先尽量将组织剪成块， 然后加有蛋白酶抑制剂 的冷匀浆液进行匀浆， 过滤或离心收集。
5.玻璃珠匀浆法
剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物 应用对象：细胞悬液或微生物 操作步骤：用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置
2.压力杯法
在高压下迫使细胞穿过小孔径而 产生剪切力，从而裂解细胞。 应用对象：微生物细胞，如细菌、
霉菌、酵母细胞及含有 细胞壁的细胞。 操作步骤：将细胞悬浮液置于预冷 的压力杯中，施加压 力，然后收集挤出液。
3.研磨法
用研钵或研杵研磨细胞 应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。 操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研
4.可溶性样品 是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑 脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。
二、组织与细胞破碎
为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进 行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细 胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种 分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。
➢ 尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。 ➢ 细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和
蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。 ➢ 样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于-80 ℃。勿反
复冻融已制备好的样品。 ➢ 通过超速离心清除所有的杂质。 ➢ 加入尿素后加温不要超过37 ℃，防止氨甲酰化而修饰蛋
⑸ 甲苯磺酰赖氨酸甲酮（TLCK），甲苯磺 酰
苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）
通常浓度在0.1-0.15mmol/L，这些相同的成分 不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。
蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些 蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。
（一）温和的裂解方法
通常应用于组分比较简单的样品，例如组织 培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分 析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、 完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合 起来应用。
求为止。
3. 裂解液裂解
含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜，使细胞内容物释放出来。 应用对象：组织培养细胞 操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行
悬浮处理。
4.酶裂解
有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解。 应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。 操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。
ห้องสมุดไป่ตู้
⑴ PMSF(苯甲基磺酰氟）
是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/L, 灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是 其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现 加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（DTT）或者 β-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减小， 因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。
二、剧烈的蛋白裂解
常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞， 或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方 法可以使细胞完全破碎裂解。
1. 超声裂解法
超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细 胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。 应用对象：悬浮细胞 操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，
样品处理应在冰浴中进行。
第二章 蛋白质样品的制备
蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一
步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样 品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究 的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的 蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和 物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具 有难度的。
样品制备的原则
于结实的管子里。每克细胞（湿重） 加入1-3克玻璃珠，剧烈震荡1min， 冰浴1min。重复上述步骤。
三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解
当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这会 严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。 如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低 温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备。 另外，许多组织蛋白酶在PH超过9.0的时候会失 活，因此在样品裂解液中出现Tris、碳酸钠和载 体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这些 方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述条 件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要应用 蛋白酶抑制剂。
白。
第一节 样品破碎与分离蛋白质
一、样品的类型
1.整体样品 是生物个体小的物种（如微生物），可以整体 取样。
2.组织样品 有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。
3.细胞样品 包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长 的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细 胞）和从组织中分离同类的细胞样品。
1. 渗透裂解
非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级 应用对象： 血细胞、组织培养细胞。 操作步骤： 将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶
胀而释放出细胞内容物。
2. 冻融裂解
许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解 应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。 操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要
⑵ AEBSF
为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/L， 作用与PMSF相似，但溶解性较好，且毒性低。 但
是AEBSF可能会改变蛋白的等电点。
⑶ 金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（EDTA）
乙二醇双四乙酸（EGTA）
通常应用1mmol/L的工作浓度，通过螯合自由的金属离 子来抑制金属蛋白酶活性。
⑷ 肽蛋白酶抑制剂
磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。
4. 机械匀浆法
使用匀浆器破碎细胞或组织 应用对象：固体组织，如心脏、肝
脏、肾脏组织和细胞悬 液。 操作步骤：先尽量将组织剪成块， 然后加有蛋白酶抑制剂 的冷匀浆液进行匀浆， 过滤或离心收集。
5.玻璃珠匀浆法
剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物 应用对象：细胞悬液或微生物 操作步骤：用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置
2.压力杯法
在高压下迫使细胞穿过小孔径而 产生剪切力，从而裂解细胞。 应用对象：微生物细胞，如细菌、
霉菌、酵母细胞及含有 细胞壁的细胞。 操作步骤：将细胞悬浮液置于预冷 的压力杯中，施加压 力，然后收集挤出液。
3.研磨法
用研钵或研杵研磨细胞 应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。 操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研
4.可溶性样品 是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑 脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。
二、组织与细胞破碎
为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进 行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细 胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种 分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。
➢ 尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。 ➢ 细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和
蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。 ➢ 样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于-80 ℃。勿反
复冻融已制备好的样品。 ➢ 通过超速离心清除所有的杂质。 ➢ 加入尿素后加温不要超过37 ℃，防止氨甲酰化而修饰蛋