第二章蛋白质样品的制备
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第二章 蛋白质分离纯化技术(2)
28
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
温度
0℃ 20℃ 80℃ 100℃
（NH4)2SO4 70.6 75.4
95.3
103
Na2SO4 4.9 18.9
43.3
42.2
NaH2PO4 1.6
7.8 93.8
101
1）硫酸铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类
29
2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫 酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂 蛋白，纯度提高了四倍。
3) 温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白 质和酶，提取时一般在0℃～5℃的低温操作。
4) 防止蛋白酶的降解作用：加入抑制剂或调节提 取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解 酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶的降 解作用。
15
5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解， 一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大 量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等 物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当 数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需 基团，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气 接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的 二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入 少量巯基乙醇或二硫苏糖醇以防止巯基氧化。
1) 盐浓度（即离子强度）：
离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，绝大多数蛋 白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在 纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增 加，称为“盐溶”现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的 活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了 溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。
带正电荷蛋白质
（疏水胶体）
阴离子
不稳定蛋白颗粒
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
温度
0℃ 20℃ 80℃ 100℃
（NH4)2SO4 70.6 75.4
95.3
103
Na2SO4 4.9 18.9
43.3
42.2
NaH2PO4 1.6
7.8 93.8
101
1）硫酸铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类
29
2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫 酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂 蛋白，纯度提高了四倍。
3) 温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白 质和酶，提取时一般在0℃～5℃的低温操作。
4) 防止蛋白酶的降解作用：加入抑制剂或调节提 取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解 酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶的降 解作用。
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5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解， 一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大 量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等 物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当 数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需 基团，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气 接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的 二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入 少量巯基乙醇或二硫苏糖醇以防止巯基氧化。
1) 盐浓度（即离子强度）：
离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，绝大多数蛋 白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在 纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增 加，称为“盐溶”现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的 活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了 溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。
带正电荷蛋白质
（疏水胶体）
阴离子
不稳定蛋白颗粒
第二章样品的采取、制备、处理与保存
第二章样品的采取、制备、处理与保存第一节样品的采取●1、采样：从产品中抽取有一定代表性样品，供分析化验用，叫作采样。
●2、样品分类：●检样：由整批食物的各个部分采取的少量样品称为检样●原始样品：把许多份检样综合在一起称为原始样品。
其组成成分能代表全部物料的成分。
●平均样品：原始样品经过处理再抽取其中一部分作检验用者称为平均样品。
●2、采样的一般方法：样品不同所采用的方法也不同。
●（1）散粒状样品（如粮食、粉状食品）●可用双套回转取样管插入容器中，回转一百八十度取出样品，每一包装须由上、中、下三层取出三份检样，把许多检样合起来成为原始样品，原始样品用四分法做成平均样品，即将原始样品充分混合均匀后堆集在清洁的玻璃板上，压平成厚度在3厘米以下的正方形并划成对角线，将样品分成四份，取两对角的二份，再如上混合，分为四份，取两对角的二份，这样操作至取得所需数量为止，此即是平均样品。
或把样品做成圆形进行混合、四分，来取得平均样品。
●（2）较稠的半固体样品（如稀奶油）●可用采样器从上、中、下层分别取出检样，然后混合缩减至得到所需数量的平均样品。
●（3）液体样品●在采样前须充分混合，混合时可用混合器，如容器内被检物量不多时，可用由这一容器转移到另一容器的方法来混合。
采样用长形管或特制采样器。
一般可用虹吸法分层取样，每层各取500毫升左右，装入小口瓶中混匀。
●（4）小包装的样品●如罐头、瓶装奶粉等连包装一起采样。
●（5）鱼、肉、蔬菜等组成不均匀样品●视检验目的，可由被检物各个部分分别采样，须从有代表性的各部位（如肌肉、脂肪等，蔬菜之根、茎叶等）分别采样，经过充分打碎混合后成为平均样品。
将样品装入预先洗净烘干的广口瓶中，瓶签上注明名称、采样日期、交货数量、采样方法及其他应说明的情况，并由经手人签封。
第二节样品的制备与预处理●一、样品的制备●1、样品的制备：是指对采取的样品进行分取、粉碎及混匀等过程。
●制备的目的：要保证样品十分均匀，使在分析时取任何部分都能代表全部样品的成分。
动物生物化学 第二章 蛋白质
肽链内形成氢键，氢键的取向 几乎与轴平行，第一个氨基酸 残基的酰胺基团的-CO基与第 四个氨基酸残基酰胺基团的NH基形成氢键（包含13个原 子）。
蛋白质分子为右手-螺旋。
（1）-螺旋
-螺旋
表 几种螺旋结构参数
结构类型 残基/圈 1个氢键环的原子数 每个残基高度（nm） Φ Ψ
310螺旋 3.0
位 置
及顺序分析，
的 然后同其它方法分析的肽段进行比较，
确 确定二硫键的位置。
定
2.4 蛋白质的高级结构
2.4.1 肽单位平面结构和二面角
O
O
O
H
H
H
H2N
C
C
N H
C
C
N H
C
C
R
R
R
N端
肽单位
肽单位
O
H
H
NH C C N C COOH
H
R
R
C端
肽单位： 主肽链中的重复单位
肽键平面—由于肽键的双键性质，使得形成肽键的N、C原子以及它们相 连的四个原子形成一个平面，这个平面就叫肽键平面。
蛋白质构件分子是氨基酸。 氨基酸是蛋白质的基本单位。 自然界存在的氨基酸有300多 种，但合成蛋白质的氨基酸只 有20种，都属于α-氨基酸，其 中除甘氨酸外，其余都是L-α氨基酸。
蛋白质分子中的20种 氨基酸在DNA分子中有它 们特异的遗传密码相对应，
因而也称编码氨基酸 （Coding amino acid）。 新近发现的硒代半胱氨酸 （SeCys）也是一种编码 氨基酸。
由 两 个 氨 基 酸 组 成 的 肽 称 为 二 肽 ， 由 多 个 氨 基酸组成的肽则称为多肽。因为多肽呈链状， 所以又称为多肽链。组成多肽的氨基酸单元称 为氨基酸残基。
蛋白质分子为右手-螺旋。
（1）-螺旋
-螺旋
表 几种螺旋结构参数
结构类型 残基/圈 1个氢键环的原子数 每个残基高度（nm） Φ Ψ
310螺旋 3.0
位 置
及顺序分析，
的 然后同其它方法分析的肽段进行比较，
确 确定二硫键的位置。
定
2.4 蛋白质的高级结构
2.4.1 肽单位平面结构和二面角
O
O
O
H
H
H
H2N
C
C
N H
C
C
N H
C
C
R
R
R
N端
肽单位
肽单位
O
H
H
NH C C N C COOH
H
R
R
C端
肽单位： 主肽链中的重复单位
肽键平面—由于肽键的双键性质，使得形成肽键的N、C原子以及它们相 连的四个原子形成一个平面，这个平面就叫肽键平面。
蛋白质构件分子是氨基酸。 氨基酸是蛋白质的基本单位。 自然界存在的氨基酸有300多 种，但合成蛋白质的氨基酸只 有20种，都属于α-氨基酸，其 中除甘氨酸外，其余都是L-α氨基酸。
蛋白质分子中的20种 氨基酸在DNA分子中有它 们特异的遗传密码相对应，
因而也称编码氨基酸 （Coding amino acid）。 新近发现的硒代半胱氨酸 （SeCys）也是一种编码 氨基酸。
由 两 个 氨 基 酸 组 成 的 肽 称 为 二 肽 ， 由 多 个 氨 基酸组成的肽则称为多肽。因为多肽呈链状， 所以又称为多肽链。组成多肽的氨基酸单元称 为氨基酸残基。
gsg-第二章 生物样品的制备
32
细胞破碎相关的器械与器材
• 1)电动组织捣碎机
• 原理：用可调速电机驱动捣碎转子（头）在 高速旋转下将组织打碎达到匀浆目的。 • 市售仪器多数是可调速机型，有不同口径 、头端式样的转子供选择，平头转子适于 制备乳浊液及悬浮液，锯齿状转子适于制 备组织和含纤维物质的匀浆。 • 应用：一般用于动物组织，植物肉质种子， 柔嫩的叶、芽等材料。国产的捣碎机最高 转速可达1-2万转/分，因旋转刀刃的机械 切力很大，制备较大分子样品很少使用。 动、植物细胞30-45秒完全破碎，酵母菌和 细菌需加入石英砂加强效果。
2. 通过文献调研和预备性实验，掌握目标产物的物理、 化学以及生物学性质
3. 生物材料的破碎和预处理 4. 分离纯化方法的选择和探索 5. 选择相应、可靠的分析技术，建立鉴定生物分子制备 物的均一性（即纯度）的方法 6. 产物的浓缩、干燥和保存 基本原则： 以尽可能少的步骤、尽可能短的时间，获得 尽可能多的目标产品
可将自然流出的唾液1～2mL ，置干净容器内置冰冻保存 ，或者立即
放水浴中煮沸10min，灭活唾液中的血型分解酶活性，然后置4℃冰箱 保存。
18
生物材料的选择
（四）组织 1.匀浆化法（简单，回收率低）
2.蛋白沉淀法（简单，回收率低）
3.酸碱水解（适合于酸碱条件下稳定的药物或毒物） 4.酶水解法（避免高温降解，不适合碱性条件下水解的 药物或毒物）
33
超声波细胞破碎机
• 原理：仪器发出一定频率的超声波产生振动力破碎细胞壁和细胞器
。由超声波发生器和超声换能器两部分极成。
• 相应超声换能器的长度及尖端口径也可挑选不同长短、粗细，以满 足0.1~250ml的容量需要。 • 应用：用于各种动植物细胞、病毒细胞、细菌及组织的破碎，也可用 于各类高分子物质的破碎，同时可用来乳化、分离、匀化、提取、消
细胞破碎相关的器械与器材
• 1)电动组织捣碎机
• 原理：用可调速电机驱动捣碎转子（头）在 高速旋转下将组织打碎达到匀浆目的。 • 市售仪器多数是可调速机型，有不同口径 、头端式样的转子供选择，平头转子适于 制备乳浊液及悬浮液，锯齿状转子适于制 备组织和含纤维物质的匀浆。 • 应用：一般用于动物组织，植物肉质种子， 柔嫩的叶、芽等材料。国产的捣碎机最高 转速可达1-2万转/分，因旋转刀刃的机械 切力很大，制备较大分子样品很少使用。 动、植物细胞30-45秒完全破碎，酵母菌和 细菌需加入石英砂加强效果。
2. 通过文献调研和预备性实验，掌握目标产物的物理、 化学以及生物学性质
3. 生物材料的破碎和预处理 4. 分离纯化方法的选择和探索 5. 选择相应、可靠的分析技术，建立鉴定生物分子制备 物的均一性（即纯度）的方法 6. 产物的浓缩、干燥和保存 基本原则： 以尽可能少的步骤、尽可能短的时间，获得 尽可能多的目标产品
可将自然流出的唾液1～2mL ，置干净容器内置冰冻保存 ，或者立即
放水浴中煮沸10min，灭活唾液中的血型分解酶活性，然后置4℃冰箱 保存。
18
生物材料的选择
（四）组织 1.匀浆化法（简单，回收率低）
2.蛋白沉淀法（简单，回收率低）
3.酸碱水解（适合于酸碱条件下稳定的药物或毒物） 4.酶水解法（避免高温降解，不适合碱性条件下水解的 药物或毒物）
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超声波细胞破碎机
• 原理：仪器发出一定频率的超声波产生振动力破碎细胞壁和细胞器
。由超声波发生器和超声换能器两部分极成。
• 相应超声换能器的长度及尖端口径也可挑选不同长短、粗细，以满 足0.1~250ml的容量需要。 • 应用：用于各种动植物细胞、病毒细胞、细菌及组织的破碎，也可用 于各类高分子物质的破碎，同时可用来乳化、分离、匀化、提取、消
第二章 样品的采集、制备处理及保存
第二章 食品样品的采集与处理
图2-2 萃取操作示意 1-三角瓶；2-导管；3-冷 凝器；4-欲萃取相
图2-3 常压蒸馏装置
3、盐析法：溶液中加入某种盐类，降低了 某溶质在溶液中的溶解度，使 之从溶液中分离出来的方法。
4、超临界萃取法（SFE） Supercritical Fluid Extraction
超临界流体及其性质 a.流体是非液非气的,具有气体较强的穿透 能力和液体较大的密度及溶解度,有较大 的吸附能力,流动性好. b.萃取速度快
什么物质适合于二氧化碳超临界萃取 二氧化碳超临界萃取的优点
a. 接近常温, 对物质没有变解作用. b. 易达到Pc和Tc c. 化学稳定性好, 无毒, 无色, 无味, 无污染 d. 萃取时间短 e. 费用低 f. 适用热敏感样品 g. 有防氧化和抑菌作用
然后层从的样四品角堆和放中
的不心同点部用位双，套按回
采样转件取数样确器定各具取
体采少样量袋样(品桶，、得
箱)检，样再，用再双按套上回
转取法样处管理采得样平。均
将取样样品管。插入包
装中，回转180。
取出样品，每一
包装须由上、中、
下三层取出三份
检样；把许多检
样综合起来成为
原始样品：用
“四分法”
这类物料不易充 分混匀，可先 按 总件数/ 2 确 定采样件(桶、 罐)数。启开 包装，用采样 器从各桶(罐) 中分层(一般 分上、中、
特点：简便快速，破坏彻底，减少 金属挥发。酸气刺激性大， 腐蚀性大。
第二章 食品样品的采集与处理
（1）硫酸-硝酸法 如图2-1所示。
（2）高氯酸-硝酸-硫酸法
（3）高氯酸（过氧化氢）-硫 酸法
（4）硝酸-高氯酸法
第2章 蛋白质和主要必需氨基酸的测定
第二章 蛋白质和主要必需 氨基酸的测定
第一节 概述
蛋白质是植物的重要组成成分，也是农产品品质中最重 要的成分。
它的含量依作物种类、部位、生育时期、品种特性而有
变化。植物各部位器官中蛋白质含量也不同，其中以籽 粒中最多，如豆类可达45％-55％，其次是花、叶、茎和 根。
作物在不同的生育阶段根部位吸收的氮，不断向新生组
赖氨酸是一种必须的氨基酸。缺乏赖氨酸，人与动物不仅不能正常
发育，还会引起某些疾病。在绝大多数谷物中，赖氨酸是最缺乏的 氨基酸，被称为第一限制氨基酸。
对人体的作用：
1．提高智力、促进生长、增强体质。 2．增进食欲、改善营养不良状况。 3．改善失眠，提高记忆力。 4．帮助产生抗体、激素和酶，提高免疫力、增加血色素。
较慢，试剂费用较高。
近年已出现几种以开氏法原理为基础的全自动或半自
动的开氏定氮仪。
瑞典的Tecator公司生产的开氏1030分析仪(Kjeltec Auto 1030 Analyzer)、日本生产的kjel-Auto自动氮和 蛋白质分析仪和丹麦FOSS公司生产的Kjel—FOSS自 动蛋白质分析仪等。
二酮炔-茚二酮胺(DYDA)，显色（570nm）后的氨基酸由光度计 检测。
氨基酸自动分析仪
操作步骤
(1) 全氨基酸试样的制备（盐酸水解）。 (2) 胱氨酸及色氨酸的水解（盐酸分解过程
中破坏，需另行制备）。
(3) 植物性产品中游离氨基酸试样的制备。 (4) 上机测定。
二、谷物和饲料中赖氨酸的测定 ——染料结合法-DBL法
0.01 mol· -1(1/2H2SO4)或0.02 mol· -1 HCl标准溶液。 L L 其他试剂同第四章(土壤全氮的测定)。
第一节 概述
蛋白质是植物的重要组成成分，也是农产品品质中最重 要的成分。
它的含量依作物种类、部位、生育时期、品种特性而有
变化。植物各部位器官中蛋白质含量也不同，其中以籽 粒中最多，如豆类可达45％-55％，其次是花、叶、茎和 根。
作物在不同的生育阶段根部位吸收的氮，不断向新生组
赖氨酸是一种必须的氨基酸。缺乏赖氨酸，人与动物不仅不能正常
发育，还会引起某些疾病。在绝大多数谷物中，赖氨酸是最缺乏的 氨基酸，被称为第一限制氨基酸。
对人体的作用：
1．提高智力、促进生长、增强体质。 2．增进食欲、改善营养不良状况。 3．改善失眠，提高记忆力。 4．帮助产生抗体、激素和酶，提高免疫力、增加血色素。
较慢，试剂费用较高。
近年已出现几种以开氏法原理为基础的全自动或半自
动的开氏定氮仪。
瑞典的Tecator公司生产的开氏1030分析仪(Kjeltec Auto 1030 Analyzer)、日本生产的kjel-Auto自动氮和 蛋白质分析仪和丹麦FOSS公司生产的Kjel—FOSS自 动蛋白质分析仪等。
二酮炔-茚二酮胺(DYDA)，显色（570nm）后的氨基酸由光度计 检测。
氨基酸自动分析仪
操作步骤
(1) 全氨基酸试样的制备（盐酸水解）。 (2) 胱氨酸及色氨酸的水解（盐酸分解过程
中破坏，需另行制备）。
(3) 植物性产品中游离氨基酸试样的制备。 (4) 上机测定。
二、谷物和饲料中赖氨酸的测定 ——染料结合法-DBL法
0.01 mol· -1(1/2H2SO4)或0.02 mol· -1 HCl标准溶液。 L L 其他试剂同第四章(土壤全氮的测定)。
第02章 生物制品制备的一般步骤
方法：离心、膜过滤、自然沉降。
目的：将细胞碎片或未充分破碎的组织等杂质去掉。 （三）目的产物的分离纯化 除去可溶性杂质，同时富集目的产物的过程，称之为分
离纯化。这是生物制品制备的核心。
方法：沉淀技术、离心技术、过（超）滤技术、层析技术、 萃取技术、电泳技术等，是生物制品制备的常用技术。 但应注意，生物分子千差万别，不同的目的产物，由于其 物理、化学性质不同，生物学特性迥异，因此没有一个方法适 合于任何生物制品的分离纯化
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
凝胶过滤法： 又称分子筛层析法
分子筛层析示意图
蛋白质洗脱体积与分子量的关系
将几种已知分子量的蛋白质混合溶液上柱洗脱，记录各种蛋白质的洗脱 体积。以分子量的对数为纵坐标，以洗脱体积为横坐标，作标准曲线。 待测蛋白质溶液在上述相同的层析条件下分离，记录其洗脱体积，然后 根据标准曲线计算其分子量。
四、蛋白质提取、纯化的一般步骤
1.选材： 制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。 原则：原材料来源充足；目标蛋白含量丰富；易于处理 和提取。 2.生物材料的破碎和预处理：常用的方法有组织匀浆法、
研磨、反复冻融、溶菌酶、高压破碎等。
目的：将目标蛋白以可溶态充分暴露出来，并与其他成 分分离。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3.粗分离：将绝大多数杂质去掉的过程。方法多为离心、
离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确
估计和判断，因而实验结果常有很大的经验成份，实验重复性 较差，个人的实验技术水平和经验对实验结果有较大的影响。
三、蛋白质提取、纯化前的准备
在进行蛋白质的制备前，通常需要对以下几方面的内容加
以确定或预先了解。 ①明确实验目的和要求。科研、开发，还是要发现新的物 质。 ②通过文献调研和预备性实验，掌握目的蛋白质的理化性 质和生物学特性。如分子大小；溶解度；电荷；吸附性质；热 稳定性；对配体分子的生物学亲和力等。 ③建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备蛋白质的关 键。 ④确定可能的技术路线和实验方案，这是最困难的过程， 要求具有很高的综合知识和实验技术水平。
蛋白质样品的制备
求为止.
3. 裂解液裂解
含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜,使细胞内容物释放出来. 应用对象：组织培养细胞 操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中,进行
悬浮处理.
4.酶裂解
有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解. 应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞. 操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中.
⑴ 硫酸铵沉淀 盐析
原理：在高盐溶液中,蛋白倾向于聚合,并从溶液中沉淀下
来.许多潜在的杂质如核酸将保持在溶液中.
步骤：蛋白浓度大于lmg/ml,缓冲液浓度大于50mmol/L,并 含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和,搅拌10-30min,通过离 心沉淀蛋白.
然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的,因此,这种方法 只能被用来预分离或富集蛋白.并且,残存的硫酸铵会干扰 IEF,必须被清除.
二、裂解技术
⑴ 裂解液的组成
裂解液基本成分包括：脲、一种或几种去污剂还原剂、 固相PH梯度缓冲液也可以增强样品的溶解性
脲：可溶解和折叠大多数的蛋白质,形成完全随机的构 象,使所有的离子基团暴露于溶液中硫脲的加入可以进 一步提高溶解度,特别是对膜蛋白
去污剂：确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用 导致蛋白质聚合
3.消除各种细胞或组织混杂的影响
二、样品制备的原则
1.尽可能采用简单的方法进行样品的处理
2.尽可能的提高样品的溶解度,使所有待分析的蛋白质样品全部处 于溶解状态,且制备方法应具有可重现性.
3.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解,低温和蛋白酶 抑制剂以防止蛋白的降解.
4.样品制备过程中,防止发生人为的蛋白质样品化学修饰.加入尿素 后加温不要超过37 ℃,防止氨甲酰化而修饰蛋白
3. 裂解液裂解
含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜,使细胞内容物释放出来. 应用对象：组织培养细胞 操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中,进行
悬浮处理.
4.酶裂解
有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解. 应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞. 操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中.
⑴ 硫酸铵沉淀 盐析
原理：在高盐溶液中,蛋白倾向于聚合,并从溶液中沉淀下
来.许多潜在的杂质如核酸将保持在溶液中.
步骤：蛋白浓度大于lmg/ml,缓冲液浓度大于50mmol/L,并 含有EDTA,缓慢加入硫酸铵至饱和,搅拌10-30min,通过离 心沉淀蛋白.
然而许多蛋白在高盐溶液中是可溶的,因此,这种方法 只能被用来预分离或富集蛋白.并且,残存的硫酸铵会干扰 IEF,必须被清除.
二、裂解技术
⑴ 裂解液的组成
裂解液基本成分包括：脲、一种或几种去污剂还原剂、 固相PH梯度缓冲液也可以增强样品的溶解性
脲：可溶解和折叠大多数的蛋白质,形成完全随机的构 象,使所有的离子基团暴露于溶液中硫脲的加入可以进 一步提高溶解度,特别是对膜蛋白
去污剂：确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用 导致蛋白质聚合
3.消除各种细胞或组织混杂的影响
二、样品制备的原则
1.尽可能采用简单的方法进行样品的处理
2.尽可能的提高样品的溶解度,使所有待分析的蛋白质样品全部处 于溶解状态,且制备方法应具有可重现性.
3.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解,低温和蛋白酶 抑制剂以防止蛋白的降解.
4.样品制备过程中,防止发生人为的蛋白质样品化学修饰.加入尿素 后加温不要超过37 ℃,防止氨甲酰化而修饰蛋白
第二章实验一蛋白质含量的测定_凯氏定氮法
定仪的方法；第三法燃烧法
GB 5009.5-2016 常见食物中的氮折算成蛋白质 的折算系数
凯氏定氮法测定蛋白质含量
教学目标
1. 知识：凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和 方法
2. 能力：凯氏定氮仪的使用 3. 素养：培养良好法律意识和科学素养、自然
辨证的方法论正确理解事物发展、关注社会 特点-疫情发展
注意事项
1. 蒸馏过程中，火力要稳，防倒吸。 2. 蒸馏结束时，先移开锥形瓶，再挪动酒精
灯，防锥形瓶中液体倒吸。 3. 蒸馏完样品，及时趁热清洗反应室，并换
掉废液。
Folin－酚试剂法
碱性条件，肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸 盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基 还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混 合物）。在一定的条件下，蓝色深度 与蛋白的量成正相关。
浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液 中氢离子浓度降低。
4. 用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来 氢离子浓度为止。
5. 根据所用标准酸的当量数(相当于待测物中 氨的当量数)计算出待测物中的总氮量。
2008年三聚氰胺事件
Melamine三聚氰胺
Melamine C3N3(NH2)3 Nitrogen content 66.6%； Urea Nitrogen content 46.5%
实验原理
1. 含氮的有机物与浓硫酸共热，其中的碳、氢 元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成 氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过 程通常称之为“消化”。
2. 此反应进行比较缓慢，通常需要加入硫酸钾 或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸 铜作为催化剂，以促进反应的进行。
3. 浓碱使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨， 借水蒸汽法，1976 年建立起来的一种蛋白质浓度的测 定方法。
GB 5009.5-2016 常见食物中的氮折算成蛋白质 的折算系数
凯氏定氮法测定蛋白质含量
教学目标
1. 知识：凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和 方法
2. 能力：凯氏定氮仪的使用 3. 素养：培养良好法律意识和科学素养、自然
辨证的方法论正确理解事物发展、关注社会 特点-疫情发展
注意事项
1. 蒸馏过程中，火力要稳，防倒吸。 2. 蒸馏结束时，先移开锥形瓶，再挪动酒精
灯，防锥形瓶中液体倒吸。 3. 蒸馏完样品，及时趁热清洗反应室，并换
掉废液。
Folin－酚试剂法
碱性条件，肽键与铜结合生成复合物。 Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸 盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基 还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混 合物）。在一定的条件下，蓝色深度 与蛋白的量成正相关。
浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液 中氢离子浓度降低。
4. 用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来 氢离子浓度为止。
5. 根据所用标准酸的当量数(相当于待测物中 氨的当量数)计算出待测物中的总氮量。
2008年三聚氰胺事件
Melamine三聚氰胺
Melamine C3N3(NH2)3 Nitrogen content 66.6%； Urea Nitrogen content 46.5%
实验原理
1. 含氮的有机物与浓硫酸共热，其中的碳、氢 元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成 氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过 程通常称之为“消化”。
2. 此反应进行比较缓慢，通常需要加入硫酸钾 或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸 铜作为催化剂，以促进反应的进行。
3. 浓碱使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨， 借水蒸汽法，1976 年建立起来的一种蛋白质浓度的测 定方法。
第二章 实验 检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质
检测生物组织中的糖类、 脂肪和蛋白质
实验 原理
实验 步骤
实验 结果
糖类的鉴定
实验原理：
多糖：淀粉遇碘变蓝色
还原糖： 葡萄糖、果糖等+斐林试剂
1. NaOH + 2CuSO4 （蓝色）
砖红色沉淀
4
Cu(OH)2（蓝色）+ Na2SO
2. CH2OH(CHOH)4CHO+2Cu(OH)2 CH2OH(CHOH)4COOH + Cu2O↓（砖红色）+ 2H2O
刚配置好 的斐林试 剂2mL 50～65.C， 2min
显色反应
实验现象：
实验结果：
浅蓝色
棕色
砖红色
脂肪的鉴定
实验原理：
脂肪 + 苏丹Ⅲ 染液 脂肪 + 苏丹Ⅳ ; 3滴苏丹Ⅲ（IV） 染液 橘黄色
（无须用显微镜观察）
实验步骤：
方法2： 花生种子(浸泡过)子叶削成薄片（利用镊子刮取 取材： 放置到玻片上）
甲液 成分及其 浓度 鉴定物质 0.1g/mL的 NaOH溶液 乙液 0.05g/mL的 CuSO4溶液
双缩脲试剂
A液 0.1g/mL的 NaOH溶液 B液 0.01g/mL的 CuSO4溶液
还原糖
蛋白质 先加A液1mL，摇匀， 后加B液4滴，摇匀
添加顺序 （现配现用）甲乙两液等量 混合后立即使用
反应条件 反应现象
紫色
紫色络合物
B液
质量浓度为 质量浓度为 0.1g/mL的NaOH溶 0.01g/mL的CuSO4 液 溶液 使用方法 先加A液，再滴加B液
实验步骤：
黄豆组织样液 或 鸡蛋蛋清稀释液（另取2mL作对照） 选材制备：
实验 原理
实验 步骤
实验 结果
糖类的鉴定
实验原理：
多糖：淀粉遇碘变蓝色
还原糖： 葡萄糖、果糖等+斐林试剂
1. NaOH + 2CuSO4 （蓝色）
砖红色沉淀
4
Cu(OH)2（蓝色）+ Na2SO
2. CH2OH(CHOH)4CHO+2Cu(OH)2 CH2OH(CHOH)4COOH + Cu2O↓（砖红色）+ 2H2O
刚配置好 的斐林试 剂2mL 50～65.C， 2min
显色反应
实验现象：
实验结果：
浅蓝色
棕色
砖红色
脂肪的鉴定
实验原理：
脂肪 + 苏丹Ⅲ 染液 脂肪 + 苏丹Ⅳ ; 3滴苏丹Ⅲ（IV） 染液 橘黄色
（无须用显微镜观察）
实验步骤：
方法2： 花生种子(浸泡过)子叶削成薄片（利用镊子刮取 取材： 放置到玻片上）
甲液 成分及其 浓度 鉴定物质 0.1g/mL的 NaOH溶液 乙液 0.05g/mL的 CuSO4溶液
双缩脲试剂
A液 0.1g/mL的 NaOH溶液 B液 0.01g/mL的 CuSO4溶液
还原糖
蛋白质 先加A液1mL，摇匀， 后加B液4滴，摇匀
添加顺序 （现配现用）甲乙两液等量 混合后立即使用
反应条件 反应现象
紫色
紫色络合物
B液
质量浓度为 质量浓度为 0.1g/mL的NaOH溶 0.01g/mL的CuSO4 液 溶液 使用方法 先加A液，再滴加B液
实验步骤：
黄豆组织样液 或 鸡蛋蛋清稀释液（另取2mL作对照） 选材制备：
第二章蛋白质的定性定量分析【共54张PPT】
2. SDS-PAGE凝胶的制备
制备分离胶
制备浓缩胶
装板
加样
电泳
卸板并进行凝胶染色
3. SDS-PAGE基本原理
➢ 影响迁移率的因素
➢ SDS 十二烷基硫酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfate) 十二烷基磺酸钠 (Sodium Dodecyl Sulfonate )
SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大 于1 mmol/L 时，SDS与蛋白质的结合比例为 1.4g
4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的 电荷差异
该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。
对各种纯化蛋白质反应不同
这是一种迅速、可靠的通过染色法测定
SDS与蛋白质之间的结合程度
SDS-PAGE基本原理
封闭非特异结合位点 注意：设立阳性对照和阴性对照，阴性对照可用免疫前血清、非相关单克隆抗体；
Watch SDS-PAGE原理
Watch SDS-PAGE原理
80-100 ug/cm2
4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白
+
pH 3
pH 7.5
Isoelectric Focusing
–
pH 10
–
pH 10
–
pH 10
–
pH 10
3–10
3–10NL 4–7 3–6
5–8
7–10
ReadyStripTM IPG Strips
第2章 生物样品制备技术
5、用以收集细胞，细胞器，生物大分子等
6、分离条件温和 ，但是温度需要控制
.
（二）等电点沉淀法
等电点沉淀法利用蛋白质是具不同等电点的两性电解质
，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离 的方法 。 由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的 蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，因此单独使用此
价格昂贵 为小分子多肽，在双向电 泳结果中出现 抑肽素pepstatin在pH9时 不能发挥其抑制作用
1 mM EDTA ， 1 mM EGTA
抑制金属蛋白酶
除去影响双向电泳的污染物 :
污染物
样品制备过程中带来的盐、残留缓冲液和 其它带电小分子
除杂技术
1、 透 析 2、 旋 转 透 析 3 、凝胶过滤 4 、沉淀 / 重悬法 1、DNase-l RNase-A 2、 超 速 离 心 3、 超 声 TCAI 丙酮沉淀法 离心
蛋白质样品处理中经常使用的添加剂:
1、变性剂 (尿素，打开氢键、增溶)
2、去垢剂 (CHAPS ，SDS等，消除疏水基团之间的相互
作用，增强蛋白质在其pI值处的溶解性)
3、两性电解质 (减少蛋白聚合，维持其溶解性)
4、还原剂 (DDT ，二硫苏糖醇，用于打开二硫键) 5、炕基化-SH (保护其不被再氧化)
由于样品可含有数千种乃至上万种生物分子同处于一个 体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的一劳永
逸的分离程序，但很多基本手段是相同的。为了避免盲目性
，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验 。
常用的分离纯化方法和技术有: 离心法、沉淀法(包括:
盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等)、透析法、色谱法、 等电聚焦制备电泳法等。
第二章实验二蛋白质浓度的测定_考马斯亮蓝染色法
三、操作步骤
1、标准曲线制作：按照下表设置试管编号，按照顺序依次加入各试剂，混 匀，在595nm处测定吸光值A，以标准蛋白质浓度为横坐标，吸光值A为 纵坐标，绘制标准曲线。
试管编号
蛋白质标准液 (ml)50ug/ml
样品（ml）
0
1
2
3
4
5
A
B
C
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
0
0.4
0.8
1.2 1.6 2.0
2.0 2.0 2.0
标准曲线制作
1、配制一系列浓度的标准溶液，设置对照管； 2、测定各标准溶液的吸光值； 3、以各吸光值为纵坐标，以对应的标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线； 4、根据待测液的吸光度求出或查找相对的浓度或含量。待测液要设定平行
管，以减少偶然误差。
从标准曲线的绘制以及为什么要设置对照管和平行管等实验过 程，引出实验需要严谨性和科学性。
四、计算:
以标准蛋白质浓度为横坐标，吸光值A为纵坐标， 绘制标准曲线。
根据待测样品液的吸光度求出或查找相对的浓度
或含量。
五、注意事项:
1.样品蛋白质含量应在10~100μg为宜。一些阳离子如K+、Na+、 Mg2+、乙醉等物质对测定无影响，大量的去污剂如SDS等会严 重干扰测定。
2.应尽快完成比色测定（最好30min内），时间放置过长，考 马氏亮蓝G250-蛋白质复合物易凝集沉淀。
酶大多是可溶性蛋白，生物制品应用广泛。
二、实验器材
仪器：旋涡混合器；紫外可见分光光度计；电子分析天平。 试剂: 标准蛋白液：牛血清白蛋白（50ug/ml)。 染液：考马斯亮蓝G250（0.01%），称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml 95%乙醇中，
生物化学 第2章 蛋白质(2)
目标蛋白质的分离纯化程序主要包括:
1 3 材料的选择； 蛋白质初步提纯；
2 组织匀浆的方法除去杂蛋白,直至完全纯化；
5 目标蛋白的鉴定。 用于研究目的蛋白质通常应保持它的生物活性。因此，在目标蛋白 质的整个分离纯化过程中要在较低温度下(0－4℃)操作，注意使用蛋 白酶(使蛋白质降解的酶)的抑制剂，避免使用剧烈条件，以免蛋白质 特定的折叠结构受到破坏。
600g,3 min.上清 沉淀：细胞核 6000g,8 min.上清 沉淀：线粒体，叶绿体， 溶酶体，过氧化酶体 沉淀：细胞质膜，高尔基 体和内质网膜的碎片 沉淀：核糖体亚基
40000g.30 min.上清 100000g.90 min.上清
细胞液
平衡密度梯度离心： 用不同的离心速度、依据被分离物的密度而进 行分离的效果；通常是将没有纯化的物质铺在密度 溶液（如蔗糖溶液，氯化铯溶液为介质，离心管内 的溶液密度从底部到顶部是浓至稀的梯度）的顶层， 通过离心（160000g，3h）细胞内各成分不停地下 沉分别达到与溶液的密度相等时的位置。其介质的 密度范围宽于被分离组分的密度。
二 蛋白质一级结构测定 蛋白质测序的一般步骤：
首先目标蛋白质分离纯化得到高度纯净的蛋白质 样品。 （1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目，末端分析， 分析多肽链的N末端和C末端。 （2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。断裂链内二硫键。 （3） 测定多肽链的氨基酸组成，酸水解或碱水解。 （4） 多肽链部分裂解成肽段，专一性酶解。 （5） 测定各个肽段的氨基酸顺序。 （6） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （7） 确定多肽链中二硫键的位置。
（五）电泳后的蛋白质检测：
考马斯亮蓝染色是常用的一项电泳染色方法,是根据 考马斯亮蓝能与蛋白质多肽链定量结合的原理而建立起的。 对于一个混合蛋白质的电泳分离来说,它只能检测样品的 分离情况；如果被检蛋白质的位置可以确定,可以将该蛋 白质的色带切下之后进行脱色,测定脱色液光吸收值,能对 该蛋白质进行定量分析。
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亮抑酶肽（leupetin），它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含 DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸 和半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂A（pepstatin A），抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑蛋白酶肽 （aprotinin），抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素 (bestatin),抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价 格昂贵，而且它们是小肽片段，可能会出现在二维电泳图谱 中，其中胃蛋白酶抑制剂A在PH=9的时候不能抑制蛋白酶。
蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些 蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。
（一）温和的裂解方法
通常应用于组分比较简单的样品，例如组织 培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分 析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、 完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合 起来应用。
2.压力杯法
在高压下迫使细胞穿过小孔径而 产生剪切力，从而裂解细胞。 应用对象：微生物细胞，如细菌、
霉菌、酵母细胞及含有 细胞壁的细胞。 操作步骤：将细胞悬浮液置于预冷 的压力杯中，施加压 力，然后收集挤出液。
3.研磨法
用研钵或研杵研磨细胞 应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。 操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研
⑸ 甲酮（TPCK）
通常浓度在0.1-0.15mmol/L，这些相同的成分 不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。
白。
第一节 样品破碎与分离蛋白质
一、样品的类型
1.整体样品 是生物个体小的物种（如微生物），可以整体 取样。
2.组织样品 有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。
3.细胞样品 包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长 的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细 胞）和从组织中分离同类的细胞样品。
1. 渗透裂解
非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级 应用对象： 血细胞、组织培养细胞。 操作步骤： 将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶
胀而释放出细胞内容物。
2. 冻融裂解
许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解 应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。 操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要
⑵ AEBSF
为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/L， 作用与PMSF相似，但溶解性较好，且毒性低。 但
是AEBSF可能会改变蛋白的等电点。
⑶ 金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（EDTA）
乙二醇双四乙酸（EGTA）
通常应用1mmol/L的工作浓度，通过螯合自由的金属离 子来抑制金属蛋白酶活性。
⑷ 肽蛋白酶抑制剂
第二章 蛋白质样品的制备
蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一
步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样 品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究 的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的 蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和 物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具 有难度的。
样品制备的原则
磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。
4. 机械匀浆法
使用匀浆器破碎细胞或组织 应用对象：固体组织，如心脏、肝
脏、肾脏组织和细胞悬 液。 操作步骤：先尽量将组织剪成块， 然后加有蛋白酶抑制剂 的冷匀浆液进行匀浆， 过滤或离心收集。
5.玻璃珠匀浆法
剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物 应用对象：细胞悬液或微生物 操作步骤：用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置
求为止。
3. 裂解液裂解
含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜，使细胞内容物释放出来。 应用对象：组织培养细胞 操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行
悬浮处理。
4.酶裂解
有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解。 应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。 操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。
4.可溶性样品 是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑 脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。
二、组织与细胞破碎
为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进 行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细 胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种 分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。
二、剧烈的蛋白裂解
常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞， 或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方 法可以使细胞完全破碎裂解。
1. 超声裂解法
超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细 胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。 应用对象：悬浮细胞 操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，
样品处理应在冰浴中进行。
➢ 尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。 ➢ 细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和
蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。 ➢ 样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于-80 ℃。勿反
复冻融已制备好的样品。 ➢ 通过超速离心清除所有的杂质。 ➢ 加入尿素后加温不要超过37 ℃，防止氨甲酰化而修饰蛋
⑴ PMSF(苯甲基磺酰氟）
是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/L, 灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是 其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现 加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（DTT）或者 β-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减小， 因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。
于结实的管子里。每克细胞（湿重） 加入1-3克玻璃珠，剧烈震荡1min， 冰浴1min。重复上述步骤。
三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解
当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这会 严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。 如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低 温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备。 另外，许多组织蛋白酶在PH超过9.0的时候会失 活，因此在样品裂解液中出现Tris、碳酸钠和载 体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这些 方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述条 件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要应用 蛋白酶抑制剂。
蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些 蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。
（一）温和的裂解方法
通常应用于组分比较简单的样品，例如组织 培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分 析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、 完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合 起来应用。
2.压力杯法
在高压下迫使细胞穿过小孔径而 产生剪切力，从而裂解细胞。 应用对象：微生物细胞，如细菌、
霉菌、酵母细胞及含有 细胞壁的细胞。 操作步骤：将细胞悬浮液置于预冷 的压力杯中，施加压 力，然后收集挤出液。
3.研磨法
用研钵或研杵研磨细胞 应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。 操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研
⑸ 甲酮（TPCK）
通常浓度在0.1-0.15mmol/L，这些相同的成分 不可逆抑制许多丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。
白。
第一节 样品破碎与分离蛋白质
一、样品的类型
1.整体样品 是生物个体小的物种（如微生物），可以整体 取样。
2.组织样品 有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。
3.细胞样品 包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长 的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细 胞）和从组织中分离同类的细胞样品。
1. 渗透裂解
非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级 应用对象： 血细胞、组织培养细胞。 操作步骤： 将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶
胀而释放出细胞内容物。
2. 冻融裂解
许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解 应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。 操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要
⑵ AEBSF
为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/L， 作用与PMSF相似，但溶解性较好，且毒性低。 但
是AEBSF可能会改变蛋白的等电点。
⑶ 金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（EDTA）
乙二醇双四乙酸（EGTA）
通常应用1mmol/L的工作浓度，通过螯合自由的金属离 子来抑制金属蛋白酶活性。
⑷ 肽蛋白酶抑制剂
第二章 蛋白质样品的制备
蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一
步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样 品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究 的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的 蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和 物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具 有难度的。
样品制备的原则
磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。
4. 机械匀浆法
使用匀浆器破碎细胞或组织 应用对象：固体组织，如心脏、肝
脏、肾脏组织和细胞悬 液。 操作步骤：先尽量将组织剪成块， 然后加有蛋白酶抑制剂 的冷匀浆液进行匀浆， 过滤或离心收集。
5.玻璃珠匀浆法
剧烈震荡的玻璃珠打破细胞壁，释放细胞内容物 应用对象：细胞悬液或微生物 操作步骤：用等体积的预冷裂解液重悬细胞，置
求为止。
3. 裂解液裂解
含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜，使细胞内容物释放出来。 应用对象：组织培养细胞 操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行
悬浮处理。
4.酶裂解
有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解。 应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。 操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。
4.可溶性样品 是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑 脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。
二、组织与细胞破碎
为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进 行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细 胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种 分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。
二、剧烈的蛋白裂解
常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞， 或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方 法可以使细胞完全破碎裂解。
1. 超声裂解法
超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细 胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。 应用对象：悬浮细胞 操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫，
样品处理应在冰浴中进行。
➢ 尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。 ➢ 细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和
蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。 ➢ 样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于-80 ℃。勿反
复冻融已制备好的样品。 ➢ 通过超速离心清除所有的杂质。 ➢ 加入尿素后加温不要超过37 ℃，防止氨甲酰化而修饰蛋
⑴ PMSF(苯甲基磺酰氟）
是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/L, 灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是 其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现 加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（DTT）或者 β-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减小， 因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。
于结实的管子里。每克细胞（湿重） 加入1-3克玻璃珠，剧烈震荡1min， 冰浴1min。重复上述步骤。
三、用蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解
当进行细胞裂解时，蛋白酶会释放出来，这会 严重影响电泳的结果，因此需要采取一些策略。 如果可能的话，直接加入强变性剂。蛋白酶在低 温下无活性，因此尽可能在低温下进行样品制备。 另外，许多组织蛋白酶在PH超过9.0的时候会失 活，因此在样品裂解液中出现Tris、碳酸钠和载 体两性电解质时也可以抑制蛋白降解。虽然这些 方法可防止蛋白降解，但是有些蛋白酶在上述条 件下仍然保持降解蛋白的活性。此时，需要应用 蛋白酶抑制剂。