第二代捕获杂交法_HC_检测HPV_DNA在宫颈癌筛查中应用

第二代捕获杂交法(HC-Ⅱ)检测HP V-DNA在宫颈癌筛查中应用
钟奇志　广东省佛山市三水区妇幼保健院　528100
中国图书分类号　R737133 文献标识码　B 文章编号　100124411(2008)0720974202
【摘　要】　目的:寻找一种方便、有效的检测宫颈HP V(人乳头瘤病毒)感染及其分型的检验方法。

方法:以自愿的方式选择聚合酶链反应(PCR)检测法和第二代杂交捕获法(HC-Ⅱ)检测HP V感染率。

对其结果进行统计学分析,检验HC-Ⅱ与PCR的结果是否存在差异。

结果:第二代杂交捕获法(HC-Ⅱ)检测人乳头瘤病毒(HP V)DNA检出率达98%以上,与PCR检出率基本相符,通过统计学方法检验无差异性。

结论:HC-Ⅱ检测HP V DNA可成为一种广泛应用的临床检验技术,作为筛查宫颈癌及癌前病变的首选方法。

【关键词】　第二代捕获杂交法(HC-Ⅱ)　宫颈癌筛查　高危型HP V(人乳头瘤病毒)
宫颈癌是严重危害妇女健康与生命的常见病。

国际医学权威证实:宫颈癌发生与高危型HP V(人乳头瘤病毒)16, 18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和68型等13个型HP V感染密切相关,特别是16和18型主要引起宫颈癌〔1,2〕,因而有必要寻找一种方便、有效的检测宫颈HP V(人乳头瘤病毒)感染及其分型的最佳检验方法。

1　资料与方法
111　资料来源　2004年6月～2006年7月本院妇科门诊病人,年龄18～64岁,按乐杰主编的第6版《妇产科学》诊断
标准诊断出有慢性宫颈炎(宫颈糜烂)、宫颈尖锐湿疣的已婚妇女,特别是有家族病变者共1700例。

做HP V检查的同时进行膜式液基薄层细胞学(TCT)检测。

以自愿的方式选择聚合酶链反应(PCR)检测法和第二代杂交捕获法(HC-Ⅱ)进行HP V感染情况检测。

112　方法
11211　标本采集　两种检验方法均要求3天内不要作阴道冲洗或使用阴道内药物;24h内不要有性生活;非月经期做检
查。

11212　HC-II检测法　按HC-II法要求暴露宫颈后,用专用小刷子置于宫颈口与黏膜交界处逆时针转3圈,停留10s,
将小刷子放于专用试管中,盖上盖子在室温中保存备用,采用HC-II-基因杂交信号放大系统可检测出13个高危型HP V -DNA。

11213　PCR检测法　按PCR检测法要求用专用棉拭子置于宫颈口与黏膜交界处取脱落细胞标本,用pH710、66mmol/L磷
酸盐缓冲液洗涤,离心后用蛋白酶K于55℃水浴作用3h,再于95℃10m in灭活蛋白酶K、收集离心后的上清液,-20℃冰箱保存备用,HP V检测试剂用量及实验步骤按说明书:试剂用量为每50μl反应体系中,含各型引物50μmol/L,4种脱氧三磷酸核苷各200μmol/L,Taq DNA聚合酶115U,模板用量10μl,反应步骤为92℃60s变性、55℃120s复性、72℃90s引物延伸,共进行35个循环。

每次设试剂空白管和已知阳性模板管对照,扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,溴乙锭染色,在紫外光下观察结果并照相记录。

可检测2个高危型HP V-DNA。

11214　仪器的选择　HC-Ⅱ法:选用美国代因公司的型号DML2000;PCR方法:选用型号美国PE5700;HP V检测试剂盒购自伊利康生物技术有限公司,试剂用量及实验步骤按说明书进行。

113　统计学处理　采用χ2检验,对比两种方法的HP V感染检出率及其分型,检验HC-Ⅱ与PCR的结果是否存在差异。

2　结果
1700例病例,以PCR检测法检测HP V感染490例,以HC-Ⅱ检测法检测出HP V感染478例,两种方法检测均阳性的有471例,两种方法检测的结果不存在明显的差异(P> 0101)。

3　讨论
311　目前检测HP V的方法　有聚合酶链反应(PCR)法、斑点杂交法、细胞学检测法、第二代杂交捕获法等。

而第二
代杂交捕获法(HC-Ⅱ)检测人乳头瘤病毒(HP V)DNA是目前国际公认的子宫颈HP V(人乳头瘤病毒)感染的最佳方法〔3,4〕。

HC-Ⅱ是一种采用免疫技术并通过化学发光使基因信号放大的检测方法,能同时检测13个型HP V(16,18, 31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和68),国外已常规用于子宫颈癌的筛查〔5〕。

PCR只能检测出HP V(16,18)两种高危型HP V;斑点杂交法操作繁琐,不适于临床应用;细胞学检测法阳性率低,只有30%～50%。

312　HC-II是筛查宫颈癌及癌前病变的首选方法　第二代基因杂交捕获技术,又称为基因杂交信号放大技术,是一种免
疫技术通过化学发光使基因杂交信号放大的检测方法,具有高度敏感性和特异性。

HC-Ⅱ无需基因扩增,可检测13种HP V高危型,它是唯一取得美国F DA认证的快速检测HP V高新技术,其检测的敏感性为88%～100%,特别是阴性预测值高达99%,HC-Ⅱ(-)就可以确认没有HP V感染,而且检测还可以报告病毒负荷(V irus Load)以追随其消长。

因此,HC-Ⅱ取材方便,依从性好,有高的敏感性和特异性,低的假阴性和假阳性,重复性好,检测设备易于操作,适合于大人群筛查。

313　PCR检测法　虽然PCR技术特异性及敏感性均较强,可
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・中国妇幼保健2008年第23卷
以检测微量DNA 的含量,但不能混有任何蛋白酶、核酸酶及
Taq 酶抑制剂。

取材较复杂,检验工序比HC -II 复杂,需要
引物的合成,引物是决定PCR 结果的关键,且需基因扩增,
PCR 只能检测出HP V (16,18)两种高危型HP V 。

从本文结果可以得出,通过对比两种方法的HP V 感染检出率及其分型。

第二代杂交捕获法(HC -Ⅱ)检测人乳头瘤病毒(HP V )DNA 检出率要达98%以上,与PCR 检出率基本相符,通过统计学方法检验无差异性,HC -ⅡHP V DNA 检测可成为一种广泛应用的临床检验技术,作为筛查宫颈癌及癌前病变的首选方法。

4　参考文献
1　Bosch FX,Lorincz A,Mu oz N et al 1The causal relati on bet w een hu 2
man pap ill omavirus and cervical cancer 1J Clin Pathol,Ap r,2002,
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2　崔满华,郑鹏生,黄冰玉et al 1尖锐湿疣及子宫颈癌组织人乳头
状瘤病毒DNA 的比较研究1中华妇产科杂志,1996,31(3):
163
3　W alboomers J MM ,Marcel VJ,M ichele M et al 1Human pap ill omavirus
is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide 1J Pathol,1999,189:12～19
4　徐　铃,齐凤菊,黄扬中1肛门生殖器区肿瘤组织中HP V 的快速
检测和分型1病毒学报,1999,15:348～352
5　Cuzick J,Beverley E,Ho L et al 1HP V testing in p ri m ary screening of
older women 1B rit J Cancer,1999,81:554～558
(2006210224　收稿)
〔编校　邹庆红〕
MMP -9、PC NA 在卵巢上皮性肿瘤中的表达及临床意义
孙淑娥　田立粮　于红丽①　哈尔滨医科大学附属第五医院妇产科(黑龙江　大庆)　163317
中国图书分类号　R73713 文献标识码　B 文章编号　100124411(2008)0720975203
①哈尔滨医科大学附属第一医院妇产科
【摘　要】　目的:探讨MM P -9、PC NA 在卵巢上皮性肿瘤中的表达和他们在卵巢上皮癌的浸润和转移中的作用。

方法:选择临床病理资料齐全的卵巢上皮性肿瘤蜡块标本76例,利用S -P 免疫组化方法检测MMP -9、PC NA 在其中的表达。

结果:两者在卵巢上皮癌组织中的阳性表达明显高于交界性、良性肿瘤,呈正相关(P <0105);MMP -9在卵巢上皮性恶性肿瘤的表达与肿瘤的分化程度有显著相关性。

结论:MM P -9、PCNA 在卵巢上皮性肿瘤中的表达明显上调;MM P -9与卵巢上皮癌的浸袭、转移有关,可作为预测转移潜能的指标,PC NA 可作为卵巢癌增殖的指标。

【关键词】　卵巢肿瘤　MMP -9　PCNA 免疫组化
Va lue of M M P -9and PCNA expressi on i n ep itheli a l ovar i a n tum or
SUN Shu -E,TI AN L i -L iang,YU Hong -L i 1The F ifth A ffiliated Hospital of Harbin M ed ical U niversity,D aqing
163317,China
〔Abstract 〕　O bjecti ve:T o investigate the exp ressi on ofMM P -9and PCNA in ep ithelial ovarian tu mor and their effect in the inva 2
si on and metastasis of ep ithelial ovarian cancer 1M ethods:Selected 76paraffin bl ocks of ep ithelial ovarian tu mors with comp lete clinical pathol ogical data,and used S -P i m munohist ochem istry t o measure the exp ressi on of MM P -9and PC NA in the m 1Results:Their positive exp ressi on rate in ep ithelial ovarian cancer were obvi ously higher than in boundary and benign tu mors,showing positive correlati on (P <0105)1The exp ressi on of MM P -9in ep ithelial ovarian tu mors was significantly correlative with the differentiated level of tu mors 1Conclusi on:The exp ressi ons of MMP -9and PCNA in ep ithelial ovarian tu mor are obvi ously increased;MMP -9is related t o the invasi on and metastasis of ep ithelial ovarian cancer,and it may serve as a p redicting fact or of metastasis potency;PC NA may serve as the fact or of p r oliferati on 1
〔Key words 〕　Ovarian tu mor;MMP -9;PC NA;I m munohist ochem istry 卵巢癌是女性生殖系统最常见的三大恶性肿瘤之一,涉及癌基因、抑癌基因表达的失调、细胞凋亡、细胞运动和迁移调控异常等方面,侵袭和转移是恶性肿瘤患者预后差的直接原因。

肿瘤细胞离开原发灶进入血液循环至转移部位,都要穿过相关组织的基底膜,转移的每一步都与肿瘤的微血管生成密切相关。

基质金属蛋白酶9(MMP -9)是基质金属蛋
白酶家族中分子量最大的酶,其主要功能是降解细胞外基质和基底膜,并参与血管内皮细胞的迁移、增殖、新生血管网形成等一系列过程〔1〕,是肿瘤血管形成最为关键的步骤之一〔2〕。

增殖细胞抗原(PC NA )是一种酸性非组蛋白核多肽,在DNA 复制中起重要作用,可作为S 期的特异性标记,肿瘤的生物学行为与细胞增殖活性密切相关〔3〕。

本研究通过免疫组化S -P 法对卵巢上皮性肿瘤中表达进行检测,探讨他们对卵巢癌侵袭、转移和预后的影响。

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579・孙淑娥等　MMP -9、PCNA 在卵巢上皮性肿瘤中的表达及临床意义　第7期。