crisper-cas-基因靶向技术教学教材
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• 其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及 向导RNA(gRNA)为核心组成，也是目前研究 中最深入的类型。
• 在II型系统中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独 参与。
• Cas9含有RuvC和HNH2个独特的活性位点，在crRNA 成熟和双链DNA剪切中发挥作用。此外，pre-crRNA转 录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Transactivating crRNA，tracrRNA)也转录出来，并且激发 Cas9和双链RNA特异性RNaseIII核酸酶对pre-crRNA进 行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复 合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA 双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链 保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪 切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链， 最终引入DNA双链断裂(DSB)。
• 目前发现的Cas包括Cas1～Cas10等多种类型。
• Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度 保守的系统。
CRISPR的工作原理
• 当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在 前导区的调控下，CRISPR被转录为长的 RNA前体(Pre RISPR RNA，precrRNA)，然后加工成一系列短的含有保守 重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识 别并结合到与其互补的外源DNA序列上发 挥剪切作用。
CRISPR担当细菌的防护罩
• CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组 中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导 区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区 (Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。
• 前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度 为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR 簇的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp， 含有回文序列，可形成发卡结构。重复序列之间 被长度为26～72bp的间隔区隔开。Spacer区域 由俘获的外Байду номын сангаасDNA组成，类似免疫记忆，当含有 同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别， 并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的 目的。
Second, the targeting specificity is determined only by a 14-ntlong region (the 12 nt of the sgRNA and the 2 nt of the PAM), which might confer off-target effects in organisms with large genomes. The theoretical sequence length for unique targeting with a 14-nt recognition sequence is 268 Mb (414).
• 通过对CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近 存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质 均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、 解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与 CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为 CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写 为Cas。
CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫，而这种特异性是 由间隔序列（spacer）决定的。
如果改造成我们的目的 基因，就可以定向的进 行基因修饰
• 目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型 即I型、II型和III型，它们存在于大约40%已 测序的真细菌和90%已测序的古细菌中。
• CRISPR／Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游 邻近的PAM区(Protospacer Adjacent Motif)的5‘-GGN18-NGG-3’特征区域中的NGG位点，而这种特征 的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一 次。研究结果表明，Cas9还可以剪切线性和超螺 旋的质粒，其剪切效率堪比限制性内切酶。
crisper-cas-基因靶向技术
CRISPR-Cas主要由两部分组成：
切割
识别
CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系
CRISP统R。（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）， 被是称细C为菌as（规用C律以R成保IS簇护PR间自a隔身ss短对oc回抗iat文病ed重毒）复的：，一存实个在际系于上统C就，RI是也SP一 是R种一位基种点因对附编付近辑攻，器击，者 的基是因一武种器双。链后D来NA，核研酸究酶人。员发现，它似乎是一种精确的万能基 因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因， 这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫 和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用
• 由于crRNA参与并且起到精确导向的作用，所以 CRISPR／Cas9打靶系统也被称为RNA导向(RNA guided)打靶系统。
Limitations of the CRISPRi method
First, the requirement for an NGG PAM sequence for S. pyogenes Cas9 limits the availability of target sites in the genome. And recent studies have suggested that the S. pyogenes Cas9 protein could partially recognize an NAG PAM, which might increase both the number of targeta -ble genome sites and that of potential off-target sites.
• 在II型系统中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独 参与。
• Cas9含有RuvC和HNH2个独特的活性位点，在crRNA 成熟和双链DNA剪切中发挥作用。此外，pre-crRNA转 录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Transactivating crRNA，tracrRNA)也转录出来，并且激发 Cas9和双链RNA特异性RNaseIII核酸酶对pre-crRNA进 行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复 合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA 双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链 保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪 切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链， 最终引入DNA双链断裂(DSB)。
• 目前发现的Cas包括Cas1～Cas10等多种类型。
• Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度 保守的系统。
CRISPR的工作原理
• 当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在 前导区的调控下，CRISPR被转录为长的 RNA前体(Pre RISPR RNA，precrRNA)，然后加工成一系列短的含有保守 重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识 别并结合到与其互补的外源DNA序列上发 挥剪切作用。
CRISPR担当细菌的防护罩
• CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组 中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导 区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区 (Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。
• 前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度 为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR 簇的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp， 含有回文序列，可形成发卡结构。重复序列之间 被长度为26～72bp的间隔区隔开。Spacer区域 由俘获的外Байду номын сангаасDNA组成，类似免疫记忆，当含有 同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别， 并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的 目的。
Second, the targeting specificity is determined only by a 14-ntlong region (the 12 nt of the sgRNA and the 2 nt of the PAM), which might confer off-target effects in organisms with large genomes. The theoretical sequence length for unique targeting with a 14-nt recognition sequence is 268 Mb (414).
• 通过对CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近 存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质 均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、 解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与 CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为 CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写 为Cas。
CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫，而这种特异性是 由间隔序列（spacer）决定的。
如果改造成我们的目的 基因，就可以定向的进 行基因修饰
• 目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型 即I型、II型和III型，它们存在于大约40%已 测序的真细菌和90%已测序的古细菌中。
• CRISPR／Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游 邻近的PAM区(Protospacer Adjacent Motif)的5‘-GGN18-NGG-3’特征区域中的NGG位点，而这种特征 的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一 次。研究结果表明，Cas9还可以剪切线性和超螺 旋的质粒，其剪切效率堪比限制性内切酶。
crisper-cas-基因靶向技术
CRISPR-Cas主要由两部分组成：
切割
识别
CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系
CRISP统R。（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）， 被是称细C为菌as（规用C律以R成保IS簇护PR间自a隔身ss短对oc回抗iat文病ed重毒）复的：，一存实个在际系于上统C就，RI是也SP一 是R种一位基种点因对附编付近辑攻，器击，者 的基是因一武种器双。链后D来NA，核研酸究酶人。员发现，它似乎是一种精确的万能基 因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因， 这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫 和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用
• 由于crRNA参与并且起到精确导向的作用，所以 CRISPR／Cas9打靶系统也被称为RNA导向(RNA guided)打靶系统。
Limitations of the CRISPRi method
First, the requirement for an NGG PAM sequence for S. pyogenes Cas9 limits the availability of target sites in the genome. And recent studies have suggested that the S. pyogenes Cas9 protein could partially recognize an NAG PAM, which might increase both the number of targeta -ble genome sites and that of potential off-target sites.