多形汉逊酵母研究进展_熊向华

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多形汉逊酵母外源基因表达系统

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多形汉逊酵母外源基因表达系统
$ 陈凤菊!，卢善发!" 胡敦孝$
［"］时也发现类似现象。
分泌两种。分泌型表达载体除含有上述部件外，还含分泌信号序列。对于 6$7、牛溶血酶和转化酶基因等，其自身的信号肽序列就足以引导在甲醇酵母中表达，对于自身没有信号序列或自身的信号肽序列不能在酵母中起作用的蛋白基因，则需将此基因与酿酒酵母 ! （ <= 、西方许旺酵 8交配因子 !!）母（ >:?@.778ABC:+; A::81+7/.*8; ）葡萄糖淀粉酶 D!<! 基因、三高血糖激素基因、黑色曲霉（ !;0+E8*F 叶真蟹（ 6.-:87,; B.+7.; ）（ G*,CH+-ABC:+; *.:/8; ）杀伤 *,; 78E+- ） D!< 基因或乳克鲁维酵母
"期
陈凤菊等：多形汉逊酵母外源基因表达系统
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用来调控外源基因的表达。它们受甲醇的强诱导，受葡萄糖和乙醇阻遏，但在低浓度甘油或葡萄糖中可解阻遏。由于有基因相似的调控机制，巴斯德毕赤酵母的醇氧化酶（ !"#!）
［!"， !#］启动子，也可以用来调控多形汉逊酵母中基因的表达。
或双交换与染色体上的同源位点发生重组，定点整合到染色体的同源位点。线性化质粒发生同源整合的频率仅为 !C 这可能是因为在多形汉逊酵母中存在着双链缺口 D ((C ，（:7F）修复系统，它能以非同源重组的方式使线性质粒重新环化，从而使质粒能够进行复制。这种修复系统的准确率可达 ’?C D @*C［!=］。 !"# 高拷贝转化子的筛选多数蛋白质的表达存在基因剂量效应，筛选高拷贝数的

利用组合策略提高汉逊酵母发酵生产D-阿拉伯糖醇

利用组合策略提高汉逊酵母发酵生产D-阿拉伯糖醇钱卫东;宁肖肖;赵德志;王兰;李梦媛;陈超;常凯【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2014(000)023【摘要】[目的]提高多形汉逊酵母发酵生产D-阿拉伯糖醇的产量.[方法]通过正交试验确定了用多形汉逊酵母DL-1发酵生产D-阿拉伯糖醇发酵培养基的最佳组分,进而结合培养温度对发酵过程的影响,获得运用变温策略提高多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法.[结果]最优发酵培养基组分为:葡萄糖200 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母浸粉12 g/L,Triton X-100 10 g/L,硫酸铵3.0 g/L,七水硫酸镁2.5g/L,磷酸二氢钾2.5 g/L;多形汉逊酵母DL-1的最适生长温度和D-阿拉伯糖醇最适合成温度分别为37℃和34℃;变温调控发酵方法为:将发酵培养基在37℃培养24h后,升温到48℃继续培养24h,再降温至34℃继续培养96 h得到发酵液.采用该方法发酵结束后D-阿拉伯糖醇产量为114.92 g/L,比恒温发酵(37℃、48℃、34℃)分别提高了30.25％、208.66％、20.93％.[结论]该方法可以提高多形汉逊酵母发酵生产D-阿拉伯糖醇.【总页数】3页(P7726-7728)【作者】钱卫东;宁肖肖;赵德志;王兰;李梦媛;陈超;常凯【作者单位】陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安710021;陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安710021;陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安710021;陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安710021;陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安710021;陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安710021;陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安710021【正文语种】中文【中图分类】S188【相关文献】1.微生物发酵产D-阿拉伯糖醇的研究进展 [J], 黄魏;王晓丹;李豆南;雷安亮;吴长贵;邱树毅2.异常汉逊酵母发酵乙酸乙酯条件优化和代谢研究 [J], 宋韡n;吕利华;赵良启3.D-阿拉伯糖醇高产酵母菌株的快速筛选方法 [J], 钱卫东;宁肖肖;王兰;蔡长龙;毛培宏;李梦媛4.表面活性剂对D-阿拉伯糖醇发酵的影响 [J], 尤翠萍;张梁;丁重阳;顾正华;石贵阳5.汉逊德巴利酵母发酵葡萄糖生产D-阿拉伯糖醇 [J], 张丽丽;廖德芳;丁重阳;张梁;王正祥;石贵阳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

多形汉逊酵母研究进展

多形汉逊酵母研究进展
熊向华;刘志敏;陈惠鹏
【期刊名称】《生物技术通讯》
【年(卷),期】2006(017)005
【摘要】作为研究甲醇代谢、过氧化物酶体稳态和硝酸盐吸收的模式生物,多形汉逊酵母近年来在基础研究领域日益受到重视.在工程应用领域,利用多形汉逊酵母表达真核外源基因有特殊的优势.譬如容易得到高拷贝,在含油酸的培养条件下能够表达膜蛋白等.已有多种外源蛋白在多形汉逊酵母系统中得到表达.本文综述了多形汉逊酵母的基本生物学性质、基础研究领域概况及其在外源基因表达方面的特点和进展.
【总页数】4页(P771-774)
【作者】熊向华;刘志敏;陈惠鹏
【作者单位】军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071;军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100071
【正文语种】中文
【中图分类】Q949.326.1;Q786
【相关文献】
1.多形汉逊酵母作为细胞工厂的应用研究进展 [J], 钱卫东;施春阳;王婷
2.富硒-GSH多形汉逊酵母的制备工艺及其抗氧化活性 [J], 钱卫东;刘婵婵;王婷;沈兰芳;李永东
3.多形汉逊酵母提高生长性能的培养基优化 [J], 刘爽; 高教琪; 薛闯; 周雍进
4.亚硒酸钠促进多形汉逊酵母DL-1合成谷胱甘肽的转录组学分析 [J], 王婷;刘婵婵;任娟;荆蓉蓉;钱卫东
5.多形汉逊酵母启动子的挖掘 [J], 纪璐璐;马小军;高教琪;周雍进
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重组肠道病毒71型疫苗(汉逊酵母)抗原冻干参考品的制备及稳定性研究

国际生物制品学杂志2020年丨2月第43卷第6期Im J BiologicaLs，December 2020, Vol. 43, No. 6• 267 ••论著•重组肠道病毒71型疫苗（汉逊酵母)抗原冻干参考品的制备及稳定性研究张改梅陈磊赵丽丽谢学超李国顺肖海峰郭林徐颖之朱芮波刘建凯顾美荣北京民海生物科技有限公司研发中心1〇26()()通信作者：顾美荣，Email: 6088gmr@【摘要】目的制备重组肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)疫苗（汉逊酵母）抗原冻干参考品，用于重组EV71疫苗(汉逊酵母)的抗原含量测定。

方法选取检定合格的重组EV71疫苗（汉逊酵母）原液.加人冻干保护剂，冷冻干燥制备重组EV71疫苗（汉逊酵母)抗原冻干参考品，对其进行保护剂抗原含量标定，并对其进行反复冻融试验，37 t、2〜8 X；和-20X；稳定性研究。

结果制备的抗原冻干参考品鉴别试验、无菌检査结果均符合规定，水分含量为1. 4%。

经标定，抗原含量的几何均值为2 146 U/ml,几何变异系数为7.2%。

10次反复冻融，抗原含量仍无明显变化;37 t放置3个月，抗原含量无明显变化;分别于2〜8 T：和-20C放置3<)个月，抗原含量仍较为稳定。

结论制备了一批稳定的、均一性良好的抗原冻干参考品，可以用于重组EV71型疫苗(汉逊酵母)抗原含量测定。

【关键词】肠道病毒71型；疫苗,合成；抗原参考品；稳定性D0I：10. 3760/cma. j. cn311962-20200831-00085Preparation and stability of freeze-dried recombinant enterovirus 71 vaccine (Hansenula)antigen referenceZhang Gaimei，Chen L ei，Zhao L ili, Xie Xuechao，Li Guoshun ♦Xiao H a ifen g，Guo L in, XuYingzhi, Zhu Ruibo, Liu Jiankai, Gu MeirongCenter o f Research and Development，Beijing Minhai Biotechnology Co.，L td.，Beijing 102600，ChinaCorresponding author ：Gu Meirong 9Email：****************【Abstract】Objective To prepare a lyophilized reference antigen of recombinant enterovirus 71(EV71) vaccine (Hansenula) for the determination of antigen content of recombinant EV71 vaccine{Hansenula).Methods Bulk of qualified recombinant EV71 vaccine (Hansenula)was selected as theraw material of reference, adding freeze-dried protective agent, then lyophilized to prepared freeze-driedrecombinant EV71 (Hansenula) vaccine antigen reference, after the calibration on the antigen content,the reference was carried on the freeze-thaw test, stored at 37 °C, 2-8 °C and _ 20 °C for the stabilitystudy. Results All the quality indexes of prepared reference met the relevant requirements, and themoisture content was 1. 4%. After calibration, geometry mean of reference antigen content was2 146 U/ml and geometric variation coefficient was 1.2%.There was no significant change in antigencontent after repeated freezing and thawing for 10 times. There was no significant change in antigencontent for 3 months at 37 °C. The antigen content remained stable at 2-8 and ~ 20 °C for 30 months,respectively. Conclusion A batch of stable and homogeneous reference antigens were prepared, whichcould be applied for the determination of antigen content in recombinant EV71 vaccine {Hansenula).【Keywords】Enterovirus 71; Vaccine，synthetic; Antigen reference; StabilityDOI ：10. 3760/cma. j. cn311962-20200831 -00085手足口病（hand，foot,and mouth disease, HFMD)是一种由多种肠道病毒引起的传染性疾病，常见于5岁以下婴幼儿[14]。

多形汉逊酵母突变菌株及多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法[发明专利]

专利名称：多形汉逊酵母突变菌株及多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法
专利类型：发明专利
发明人：钱卫东,王婷,毛培宏,宁肖肖
申请号：CN201410404466.8
申请日：20140815
公开号：CN104195059A
公开日：
20141210
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种多形汉逊酵母突变菌株及多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法，主要是采用基因工程技术，通过构建多形汉逊酵母酸性磷酸酯酶基因突变菌株，获得一株D-阿拉伯糖醇的高产突变菌株。

该方法成本低、生产周期短、易于操作，为解决D-阿拉伯糖醇来源短缺问题提供了新途径。

本发明提供的突变菌株通过葡萄糖分批补料进行生物转化生产D-阿拉伯糖醇，其底物葡萄糖的转化率为51.2％，比利用出发菌株通过葡萄糖分批补料进行生物转化生产D-阿拉伯糖醇的底物葡萄糖的转化率显著提高。

申请人：陕西科技大学
地址：710021 陕西省西安市未央区大学园1号
国籍：CN
代理机构：西安通大专利代理有限责任公司
代理人：蔡和平
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一种重组多形汉逊酵母菌及其制备方法[发明专利]

专利名称：一种重组多形汉逊酵母菌及其制备方法
专利类型：发明专利
发明人：李启明,张靖,张学峰,梁宇,靳玉琴,马智静,陈实,于洁申请号：CN201110352508.4
申请日：20111108
公开号：CN103087933A
公开日：
20130508
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种重组多形汉逊酵母菌及其制备方法。

本发明的重组多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)包含乙肝病毒的L蛋白的编码基因和S蛋白的编码基因。

本发明的多形汉逊酵母菌与现有技术相比具有以下优点和积极效果：本发明的酵母菌能够在体内自行装配成VLP，其与HBV天然病毒颗粒最为接近，理论上对HBV感染具有更好的免疫保护效果。

本发明所提供的酵母菌具有较好的遗传稳定性，并能以甲醇或甘油作为唯一碳源，实现阻遏/解阻遏的诱导表达方式，使外源蛋白高效表达。

申请人：北京生物制品研究所
地址：100024 北京市朝阳区三间房南里4号院
国籍：CN
代理机构：北京天昊联合知识产权代理有限公司
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多形汉逊酵母重组菌株及其在紫杉醇生物合成中的应用[发明专利]

专利名称：多形汉逊酵母重组菌株及其在紫杉醇生物合成中的应用
专利类型：发明专利
发明人：钱卫东,赵德志,蔡长龙,毛培宏,王婷,陈雪峰,施春阳
申请号：CN201410175122.4
申请日：20140428
公开号：CN103923848A
公开日：
20140716
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种多形汉逊酵母重组菌株及其在紫杉醇生物合成中的应用，运用低能离子注入介导红豆杉基因组总DNA转化酵母获得一株产紫杉醇的多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)重组菌株CGMCC No.8999，本发明实现了利用重组酵母菌进行生物发酵生产紫杉醇的技术突破，为解决紫杉醇来源短缺、保护我国红豆杉植物资源及其可持续发展提供新途径。

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?838FB> 4657B5693 63 :73C8FD835B> F848BF= B3C 5=8 <=BFB<58F6456<4 9: 5=64 4@458D
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汉逊酵母的甲醇代谢多形汉逊酵母属于甲醇营养型酵母，能在以甲醇为惟一碳
、源和能源的培养基上生长。这类酵母还包括假丝酵母（2’(@&’）汉逊酵母（3’(76(,8’）、毕赤酵母（=&>+&’）和球拟酵母（A9;,8957&7 ）（D85=B39> 9M6CB48 ，等 U)V。多形汉逊酵母只有 ! 个编码甲醇氧化酶的基因，其启动子是强诱导型启动子。与其他醇氧化酶不 EZa）同的是，该启动子对葡萄糖或甘油的阻遏不敏感，在葡萄糖或甘油限制或缺乏的条件下，能够被甲醇诱导 U’V。甲醇代谢途径需要甲醇氧化酶、甲醛脱氢酶（:9FDB58 C8=@N 、过氧化氢酶（<B5B>B48 ，和二羟丙酮合成酶 CF9?83B48 ， \E^ ） I1Y）等几种特殊的酶参与（图 ! ）。（C6=@CF9M@B<85938 4@35=B48 ， ^S1G ）这几种酶都贮存在过氧化物酶体（L8F9M649D8 ）中，这样细胞可以避免受到甲醇代谢产物如甲醛和过氧化氢的伤害。 EZa 是其中最重要的酶，催化甲醇氧化生成甲醛和过氧化氢，其调控发生在转录水平 U*V；而 I1Y 催化过氧化氢生成水和氧分子，在去除过氧
霉目 W 酵母科 W 汉逊酵母属，为单细胞低等真核生物。多形汉逊酵母的营养体以单倍体形式存在，有 ’ 条染色体，大小为 "-#X%-% （I;G+*.% ，即 1YII.++.0 ）的基因组大小为 EK 。多形汉逊酵母
U+，对其中 + *’* 个 #-) EK ，
:99 999 的同源八聚体，每一个单体都包含一个非共价结合的
经翻译后 =<; 作为辅因子。甲醇氧化酶单体在胞质溶胶中合成，修饰输入到细胞器过氧化物酶体中，在那里组装成具有活性的八聚体。
21X
图2
多形汉逊酵母的甲醇代谢途径
在多形汉逊酵母中，所有与硝酸盐代谢相关的基因紧密地排列成基因簇，总长 22 9X9 [6 的 ;’< 片段中大约 M8P 为编码
48BF<= B3C K6958<=39>9?<6B> BLL>6<B5693 63 F8<835 @8BF4-
F6J8C :F9D 87OBF@956< 9F?B364D4A 47<= B4 8B4@ 48>8<5693 9: D7>56<9L@A 9J8FLF9C7<5693 9: =858F9>9?74 D8DKFB38 LF95863 C7FN 63? 63<7KB5693 93 9>86< B<6C- EB3@ :9F86?3 LF958634 =BJ8 K883 8MLF8448C 47<<844:7>>@ 63 3<598:19;5+’- 23 5=64 F8J68PA 5=8 KB46< K69>9?6<B> <=BFB<58F 9: 3<598:19;5+A :9F :9F86?3 ?838 8MLF844693 P8F8 C84<F6K8C［1’2 3.-"(］ 3’(76(,8’ 598:19;5+’/ D85=B39> 9M6CB48/ L8F9M649D8/ :9F86?3 ?838 8MLF844693 在过去几十年中，多形汉逊酵母（3’(76(,8’ 598:19;5+’，又已经成为一种公认的模式生物。在基础研究方称 =&>+&’ ’(),7?’）面，多形汉逊酵母被用于研究甲醇代谢、过氧化物酶体生物起源以及硝酸盐吸收机制；在生物技术方面，多形汉逊酵母系统被用于表达外源基因，特别是真核外源基因。从 %""" 年起每 % 年举办一次汉逊酵母全球网络会议（3’(76(,8’ 598:19;5+’ Q9F>CN ，迄今已成功举办了 . 届 U!$.V。 P6C8 R85P9FO I93:8F83<8 ， STQR ）生长温度为 +#] 。研究多形汉逊酵母常用的 . 个细胞株 ^_! 、 I;G+*.% 和性质不同，对其相互间的关系也不清楚。 RI‘I+#) 来源不同、
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综
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多形汉逊酵母研究进展
熊向华，刘志敏，陈惠鹏
军事医学科学院生物工程研究所，北京 !"""*! ［摘要］作为研究甲醇代谢、过氧化物酶体稳态和硝酸盐吸收的模式生物，多形汉逊酵母近年来在基础研究领域日益受到重视。在工程应用领域，利用多形汉逊酵母表达真核外源基因有特殊的优势。譬如容易得到高拷贝，在含油酸的培养条件下能够表达膜蛋白等。已有多种外源蛋白在多形汉逊酵母系统中得到表达。本文综述了多形汉逊酵母的基本生物学性质、基础研究领域概况及其在外源基因表达方面的特点和进展。［关键词］多形汉逊酵母；甲醇氧化酶；过氧化物酶体；外源基因表达［中图分类号］ ,#+#-.%’-!/ ,*0’ ［文献标识码］ 1
进行了人工注释，另外 ! !’’ 个与已知蛋白没有显著相似性。
Z[\ 的数量与已测序的芽殖酵母如酿酒酵母相似。天然多形汉
逊酵母广泛存在于污染了的橙汁、玉米面、多种昆虫的肠道及土壤中，呈白色、奶酪黄油状菌落，不形成菌丝，通过同宗配合分离，通过芽殖生长繁殖。多形汉逊酵母是一种耐热酵母，最适生（其他甲醇酵母的最适生长温度为 ."] ），最高长温度为 .*X+.]
BMD 子肽链 * 端 A 个氨基酸 %5@H!IJ!5K ，和 G#%（酶分子肽链 %L!） 8 B29D ；另一类是内部的酶分子。这 8 类分子 ’ 端 $ ? LN ? +O4N ? +!）
都由核基因编码，在游离的核糖体上合成后定向运输并组装到过氧化物酶体中。过氧化物酶体的功能是由这 8 类分子来完成的：膜上的转运蛋白将底物从细胞质中转运进入过氧化物酶体，然后在内部酶分子的作用下将底物分解，终产物又被转运回到细胞质中。因此，过氧化物酶体是一种 “来料加工” 的细胞器。当多形汉逊酵母细胞以葡萄糖为碳源时，过氧化物酶体的而当细胞从含有葡萄糖的培养基切换体积占酵母总细胞的 2P ；到以甲醇为惟一碳源和能源的培养基中时，过氧化物酶体就被诱导增殖，其体积可占到细胞总体积的 C9P。细胞中甲醇氧化酶超过细胞全蛋白的 A4P ，甲醇氧化酶和 ;+<% 加起来超过全菌蛋白的 :9P ，这也说明编码这些蛋白的基因是由强启动子控制的。从形态学上来说，在含葡萄糖的培养基中生长的细胞过氧化物酶体少而且小，当转到甲醇代谢时，过氧化物酶体体积增大。相应地，当体积达到一定大小时，原始的过氧化物酶体通过出芽形成一个新的过氧化物酶体，开始往其中输入基质酶，而此时原先的过氧化物酶体不再输入基质蛋白。一般认为，诱导形成的形体大的过氧化物酶体仅仅行使 “酶包 ” 的功能，允许细胞利用甲醇获得能量和进行同化作用，而仅由少数几个小的过氧化物酶体完成过氧化物酶体的增殖和遗传。当甲醇生长的多形汉逊酵母转到不再需要过氧化物酶体的
［!0(*-$&*］ ;863? B :BJ9FBK>8 D9C8> 9F?B364D 59 457C@ D85=B39> D85BK9>64DA L8F9M649D8 K69?838464 B3C B446D6>B5693 9: 36N
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化氢的毒性上是必不可少的； ;+<% 是甲醇异化作用途径的第一甲醇代谢途径关键酶个酶； =>; 则降解第一步反应产生的甲醛。的表达受阻遏 ? 解阻遏机制调控，乙醇、高浓度的甘油和葡萄糖阻遏基因表达，甲醇、低浓度的甘油和葡萄糖解除阻遏。在多形汉逊酵母中，甲醇氧化酶的活性形式是一个 !@ 近