重组乙肝疫苗汉逊酵母的介绍ppt课件
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8
检测正确表达目的产 物的酵母
5.筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞，获得外源基因高效表达的 基因工程菌。
4
菌种的制备及发酵
重组酵母细胞 小三角瓶
用成功构造的基因工程菌进行扩大培养，经过逐级放大至发 酵罐。原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量有机 和无机氮源；能容易进行大量有效的乙肝病毒表面抗原的生产； 生产过程中，通常常温进行，操作温和，不考虑防爆问题；生产 过程中考虑防止杂菌的污染。
5
发酵液
过滤
蛋白酶抑制剂
细胞破碎
表面活性剂
微滤
滤液
超滤
硅胶吸附
热硼酸
疏水层析
硫氰酸盐处理
氢氧化铝共沉淀
分离纯化
1.发酵结束后，通过过滤或离心，使酵母与发酵液分离，
2. 加入蛋白酶抑制剂以防抗原在细胞破碎时被分解。
3.然后细胞通过高压匀浆机破碎释放出抗原。酵母细胞较 厚，比大肠杆菌难破碎，可在高压匀浆机内施加几千个大气压， 通过针型阀突然降压到零使细胞破碎。
9.用丁基琼脂糖进行疏水层析，纯化后的抗原用硫氰酸盐处理以 完成二硫键的交联
10. 再与氢氧化铝共沉淀，此时抗原吸附在氢氧化铝上
6
纯度源自文库定
乙肝疫苗是通过肌肉注射的方式进入人体系统，为了降低疫苗内杂质含量对人体产生的 不良影响，必须进行疫苗的纯度检测。
乙肝疫苗表面抗原的纯度检定是疫苗质量控制的关键手段之一。目前分析测定重组乙 型肝炎疫苗纯度的HPLC常用方法是应用TSK-G5000PW分子筛。中国药品生物制品检定所 疫苗二室曾报道应用该系统对Merck酿酒酵母重组乙肝疫苗和CHO细胞重组乙肝疫苗进行 纯度分析，可获得良好的分离效果。对重组汉逊酵母乙肝疫苗，现有的HPLC检测系统应用 0.1mol/L DTT与1:50吐温80等量混合处理后能有效地检测不同类型重组乙肝疫苗表面抗原 的纯度。
4.细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。
5.粗细胞裂解物用0.2微米中空纤维柱进行微滤。抗原和大部分 低分子量宿主细胞内含物通过滤膜，细胞碎片被膜拦截。
6.滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分子浪宿主细胞内含 物通过滤膜除去
7.残留的表面活性剂通过吸附在聚苯乙烯小珠上除去
8.再用硅胶吸附抗原，用热硼酸缓冲液洗脱
重组乙肝疫苗（汉逊酵母） 制备
1
目录
1.背景介绍 2.重组酵母构建 3.菌种制备和发酵 4.分离纯化 5.纯度测定工艺 6.疫苗的保存
2
背景介绍
1.乙肝病毒的感染可导致慢性肝脏疾病甚至肝癌的发生。我国乙肝感染率为60%，乙肝表 面抗原携带率约为10%，有约1.2亿人携带乙肝病毒。乙肝病毒中决定乙肝病毒抗原性的蛋 白是乙型肝炎病毒（HBV薄膜蛋白），主要包括，乙肝病毒表面抗原（HBsAg）,前S1抗 原和前S2抗原
2. 乙肝疫苗的发展： 第一代乙肝疫苗
（血源性乙肝疫苗）
第二代乙肝疫苗 （基因工程疫苗）
cho细胞乙肝疫苗
重组酿酒酵母乙肝疫苗 （第一代重组酵母乙肝疫苗 ） 重组汉逊酵母乙肝疫苗 （第二代重组酵母乙肝疫苗）
3.汉逊酵母为甲基营养型酵母，基因组易操作，培养基廉价，有分泌型表达模式，正确的 折叠和修饰，产量理想，发酵液产出杂蛋白少，产物易于纯化，无热源和其他病原体，安 全性好
3
重组酵母的构建
获取目的基因
1.根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化 学合成法直接合成目的基因
构建重组质粒 导入宿主细胞
2. 用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上， 构成DNA重组分子。
3.借组细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内。
培养酵母细胞
4.短时间培养转化酵母细胞，以扩增DNA重组分子。
大三角瓶
发酵过程中，可采用分批补料或连续流加补料以保证最优生 长和维持细胞浓度、生长速度和营养供应之间的适当平衡。可添 加诱导剂如乳糖到发酵液中去以诱导可调节启动子的表达。
种子发酵罐 生产发酵罐
发现在碳源中降低葡萄糖浓度，补充甘油和蔗糖能较明显地 改善比活值和HBsAg的相对浓度。将发酵前期、中期和后期温 度分别控制在27℃、33℃、25℃；发酵从pH4.5开始，逐步上 升到pH6；以及维持溶氧浓度在最适水平（70%饱和度），都可 以提高重组质粒的稳定性和HBsAg在发酵液中的积累。
7
疫苗保存
疫苗的稳定性较差，一般在2~8℃下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。 在37℃下，许多疫苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下运输。为了使疫苗 的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥。这样，疫苗的有效期往往可延长1倍或以上，在 室温下其效价的损失亦较慢。 冻干要点是： （1）冷冻，即将疫苗冷冻至共熔点以下。 （2）真空升华，即在真空状态下降水分直接由固态升华为气态。 （3）升温缓慢，即升温的过程尽量缓慢，不使疫苗在任何时间下有融解的情况发生。 （4）冻干好的疫苗应在真空或充氮气后密封保存，使其残余水分保持在3%以下。这样的 疫苗能保持良好的稳定性。
检测正确表达目的产 物的酵母
5.筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞，获得外源基因高效表达的 基因工程菌。
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菌种的制备及发酵
重组酵母细胞 小三角瓶
用成功构造的基因工程菌进行扩大培养，经过逐级放大至发 酵罐。原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量有机 和无机氮源；能容易进行大量有效的乙肝病毒表面抗原的生产； 生产过程中，通常常温进行，操作温和，不考虑防爆问题；生产 过程中考虑防止杂菌的污染。
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发酵液
过滤
蛋白酶抑制剂
细胞破碎
表面活性剂
微滤
滤液
超滤
硅胶吸附
热硼酸
疏水层析
硫氰酸盐处理
氢氧化铝共沉淀
分离纯化
1.发酵结束后，通过过滤或离心，使酵母与发酵液分离，
2. 加入蛋白酶抑制剂以防抗原在细胞破碎时被分解。
3.然后细胞通过高压匀浆机破碎释放出抗原。酵母细胞较 厚，比大肠杆菌难破碎，可在高压匀浆机内施加几千个大气压， 通过针型阀突然降压到零使细胞破碎。
9.用丁基琼脂糖进行疏水层析，纯化后的抗原用硫氰酸盐处理以 完成二硫键的交联
10. 再与氢氧化铝共沉淀，此时抗原吸附在氢氧化铝上
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纯度源自文库定
乙肝疫苗是通过肌肉注射的方式进入人体系统，为了降低疫苗内杂质含量对人体产生的 不良影响，必须进行疫苗的纯度检测。
乙肝疫苗表面抗原的纯度检定是疫苗质量控制的关键手段之一。目前分析测定重组乙 型肝炎疫苗纯度的HPLC常用方法是应用TSK-G5000PW分子筛。中国药品生物制品检定所 疫苗二室曾报道应用该系统对Merck酿酒酵母重组乙肝疫苗和CHO细胞重组乙肝疫苗进行 纯度分析，可获得良好的分离效果。对重组汉逊酵母乙肝疫苗，现有的HPLC检测系统应用 0.1mol/L DTT与1:50吐温80等量混合处理后能有效地检测不同类型重组乙肝疫苗表面抗原 的纯度。
4.细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。
5.粗细胞裂解物用0.2微米中空纤维柱进行微滤。抗原和大部分 低分子量宿主细胞内含物通过滤膜，细胞碎片被膜拦截。
6.滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分子浪宿主细胞内含 物通过滤膜除去
7.残留的表面活性剂通过吸附在聚苯乙烯小珠上除去
8.再用硅胶吸附抗原，用热硼酸缓冲液洗脱
重组乙肝疫苗（汉逊酵母） 制备
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目录
1.背景介绍 2.重组酵母构建 3.菌种制备和发酵 4.分离纯化 5.纯度测定工艺 6.疫苗的保存
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背景介绍
1.乙肝病毒的感染可导致慢性肝脏疾病甚至肝癌的发生。我国乙肝感染率为60%，乙肝表 面抗原携带率约为10%，有约1.2亿人携带乙肝病毒。乙肝病毒中决定乙肝病毒抗原性的蛋 白是乙型肝炎病毒（HBV薄膜蛋白），主要包括，乙肝病毒表面抗原（HBsAg）,前S1抗 原和前S2抗原
2. 乙肝疫苗的发展： 第一代乙肝疫苗
（血源性乙肝疫苗）
第二代乙肝疫苗 （基因工程疫苗）
cho细胞乙肝疫苗
重组酿酒酵母乙肝疫苗 （第一代重组酵母乙肝疫苗 ） 重组汉逊酵母乙肝疫苗 （第二代重组酵母乙肝疫苗）
3.汉逊酵母为甲基营养型酵母，基因组易操作，培养基廉价，有分泌型表达模式，正确的 折叠和修饰，产量理想，发酵液产出杂蛋白少，产物易于纯化，无热源和其他病原体，安 全性好
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重组酵母的构建
获取目的基因
1.根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化 学合成法直接合成目的基因
构建重组质粒 导入宿主细胞
2. 用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上， 构成DNA重组分子。
3.借组细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内。
培养酵母细胞
4.短时间培养转化酵母细胞，以扩增DNA重组分子。
大三角瓶
发酵过程中，可采用分批补料或连续流加补料以保证最优生 长和维持细胞浓度、生长速度和营养供应之间的适当平衡。可添 加诱导剂如乳糖到发酵液中去以诱导可调节启动子的表达。
种子发酵罐 生产发酵罐
发现在碳源中降低葡萄糖浓度，补充甘油和蔗糖能较明显地 改善比活值和HBsAg的相对浓度。将发酵前期、中期和后期温 度分别控制在27℃、33℃、25℃；发酵从pH4.5开始，逐步上 升到pH6；以及维持溶氧浓度在最适水平（70%饱和度），都可 以提高重组质粒的稳定性和HBsAg在发酵液中的积累。
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疫苗保存
疫苗的稳定性较差，一般在2~8℃下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。 在37℃下，许多疫苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下运输。为了使疫苗 的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥。这样，疫苗的有效期往往可延长1倍或以上，在 室温下其效价的损失亦较慢。 冻干要点是： （1）冷冻，即将疫苗冷冻至共熔点以下。 （2）真空升华，即在真空状态下降水分直接由固态升华为气态。 （3）升温缓慢，即升温的过程尽量缓慢，不使疫苗在任何时间下有融解的情况发生。 （4）冻干好的疫苗应在真空或充氮气后密封保存，使其残余水分保持在3%以下。这样的 疫苗能保持良好的稳定性。