siRNA技术诱导基因沉默在骨科疾病中的研究进展

siRNA技术诱导基因沉默在骨科疾病中的研究进展
【关键词】RNAi；siRNA；基因；骨科疾病
中图分类号：R738.1文献标识码：ADOI：
10.3969/j.issn.10031383.2016.02.023
自从1998年Fire等[1]证实Guo等[2]发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象为RNA干扰（RNA interference，RNAi）以来，RNAi技术经历了一个迅速发展的过程。

RNAi技术是利用双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）降解细胞内同源信使RNA（messenger RNA，mRNA），从而阻断特定基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型[3]，具有高效、特异地沉默目的基因的特点[4]，其种类包括：小干扰RNA（Small Interfering RNAs，siRNA）、微小RNA（Micro RNAs，miRNA）和短发夹RNA（Short Hairpin RNAs，shRNA）。

目前，RNAi
技术已被视为分子医学领域的一个重大突破。

基于RNAi技术的性质特点及作用，其已被广泛应用于肿瘤[5]、抗病毒[6]以及遗传性疾病[7]等研究中。

尽管RNAi技术用于骨科疾病的研究尚处于初步阶段，但已经取得了一定的进步。

笔者就近年来siRNA技术诱导基因沉默在相关骨科疾病（比如骨关节炎、骨肉瘤、骨质疏松症和股骨头缺血性坏死）应用方面的研究作一综述。

1siRNA 技术在骨关节炎中的应用
骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种最常见的慢性骨关节疾病，可引起患者的关节活动受限。

随着年龄的增长，OA的发病率会逐渐增加。

然而，OA在发生和发展过程中所涉及的确切分子机制尚未阐明。

研究表明[8，9]，OA的病因是多因素的，包括遗传易感性、老化、肥胖、关节畸形或关节损伤等。

针对严重OA的治疗，目前除了全关节置换手术外，尚未发现明显有效的干预措施来减缓OA的进展或延缓软骨的退化。

随着基因工程技术的迅速发展，RNAi技术能靶向目的基因的表达。

根据RNA干扰技术的独特性质，其已作为一种有效的工具，被广泛应用于OA的研究中。

缺氧诱导因子2α（hypoxiainducible factor2α，Hif2α）是一种调节关节软骨代谢的因子，由EPAS1基因编码生成。

最近的研究表明[10]，在OA患者中，Hif2α呈现出显著的高表达状态，与Muraki等[11]研究结果相一致。

这表明，Hif2α在OA的发生及发展中可能扮演重要的作用。

Pi等[12]通过膝关节前交叉韧带切除术（ACLT）构建小鼠骨关节炎模型，单纯向关节腔内注射携带Hif2αsiRNA的靶向软骨细胞纳米颗粒发现，siRNA可下调包括Hif2α在内的多种代谢因子，并抑制降解酶的表达，阻碍关节软骨的退化。

这与Jaffe[13]研究结果相吻合，从而初步表明Hif2α是诱导关节软骨退变的重要因子。

ADAMTS5是蛋白多糖酶家族（ADAMTS）中的一员，与关节
软骨退变程度呈正相关[14]。

在体内试验和体外试验的研究中发现[15]，抑制ADAMTS5的表达能明显减轻蛋白多糖的降解、丢失，从而起到保护软骨?A作用。

这说明ADAMTS5在OA的发病机制中可能发挥至关重要的作用。

在鼠类骨关节炎模型的研究中发现[16]，通过向膝关节腔内单纯注射慢病毒载体介导的沉默ADAMTS5基因的siRNA，可引起该基因表达下调，从而抑制关节软骨的退变。

以上学者利用Hif2α和ADAMTS5对OA进行研究表明，这两种因子能影响OA发生的进程。

但OA是否还存在其他重要基因需要进一步研究。

因此，构建特异的siRNA抑制OA发生及发展相关细胞因子的表达，对OA的发生及发展有一定的抑制或延缓作用。

2siRNA技术在骨肉瘤中的应用
骨肉瘤（Osteosarcoma）是一种最常见的潜在广泛破坏性的原发性高度恶性骨肿瘤，其病因及相关发病机制尚未阐明。

目前，骨肉瘤的治疗仅局限于手术及手术前后的化疗，虽然这种综合治疗方法在一定程度上能够改善骨肉瘤患者
的状况，但仍未取得令人满意的长远效果。

骨肉瘤仍然是目前致残率和死亡率较高的恶性骨肿瘤之一[17]。

最近的报道表明，一些关键基因及分子在骨肉瘤的发生发展及分化的过程中起重要的作用，主要包括：脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1（AP endonuclease class I，APE1）、分化抑制因子（Inhibitor of DNA differentiation，Id）、热休克蛋白75（Heat shock protein
75，HSP75）等。

其中，作为恶性肿瘤之一的骨肉瘤，其发生与DNA修复相关酶的基因突变有密切关系，而APE1为DNA 修复相关酶的重要分子。

因此，APE1可能与骨肉瘤的发生密切相关。

APE1不仅能够修复DNA，而且还可以氧化还原DNA。

基于APE1这种功能，其可能有望成为治疗骨肉瘤的潜在靶点。

DAI等[18]在研究转染了AEP1siRNA 质粒的骨肉瘤细胞HOS中发现，13个miRNA发生显著改变。

其中，7个miRNA 表达上调而其余6个miRNA表达下调。

此外，该研究还发现，发生显著变化的13个miRNA及其靶基因参与骨肉瘤的发生发展，从而初步阐明AEP1siRNA可通过调节相关miRNA靶基因的表达来调控骨肉瘤的发生发展。

Id因子又称DNA 结合抑制因子，是螺旋环螺旋转录调节因子家族中唯一具有抑制细胞分化、刺激细胞增殖的负性作用的因子。

Id因子在多种肿瘤中的异常高表达已经得到研究者的广泛认可[19～21]。

Id 因子在骨肉瘤的形成中呈现出高表达状态[22]。

因此，可通过下调Id因子的表达来抑制骨肉瘤细胞的增值。

有学者[23]应用特异性针对小鼠Id1 基因的小干扰RNA 重组腺病毒（AdsimId1）感染骨肉瘤细胞K7M2WT，进一步研究Id1 基因沉默后对骨肉瘤细胞增殖的影响，并通过RTPCR 及Western Blot 的方法检测，结果显示重组腺病毒AdsimId1
感染3 d 后K7M2WT 细胞Id1 基因mRNA 及蛋白水平的表达较非处理组明显降低，其增殖受到抑制。

HSP75siRNA能
够显著降低骨肉瘤细胞HSP75蛋白的表达，明显抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移[24]，表明沉默HSP75能有效抑制人骨肉瘤
细胞的增殖和迁移。

骨肉瘤的发生发展是多基因综合作用的结果，病理过程中既有抑癌基因又有促癌基因的作用。

从骨肉瘤中发现更多抑癌基因并作为靶向治疗的靶点是目前骨
肉瘤基因治疗的首选方向。

因此，利用RNA干扰技术靶向目的基因的表达有望成为骨肉瘤治疗的新途径。

[3]田瑞敏，鄢佳程，王含彦，等.RNA干扰技术在肿瘤基因治疗中的研究现状[J].重庆医学，2013，42（7）：811814.
[4]陈春林，叶剑.RNA干扰技术及其在眼科疾病中的应用[J].眼科新进展，2008，28（1）：6064.
[5]Wu S，Wen F，Li Y，et al.PIK3CA and PIK3CB silencing by RNAi reverse MDR and inhibit tumorigenic properties in human colorectal carcinoma[J].Tumour Biol，2016.[Epub ahead of print]
[6]Wang H，Liu K，Fang BA，et al.Identification of acetyltransferase genes （HAT1 and KAT8）regulating HBV replication by RNAi screening[J].Cell Biosci，2015（5）：66.
[7]Schmidt PJ，Racie T，Westerman M，et bination therapy with a Tmprss6 RNAitherapeutic and the oral iron chelator deferiprone additively diminishes secondary iron overload in a mouse model of βthalassemia intermedia[J].Am J Hematol，2015，90（4）：310313.
[8]Rai MF，Sandell LJ.Inflammatory mediators：tracing links between obesity and osteoarthritis[J].Crit Rev Eukaryot Gene Expr，2011，21（2）：131142.
[9]Mobasheri A.Osteoarthritis year 2012 in review：biomarkers[J].Osteoarthritis Cartilage，2012，20（12）：1451164.
[10]Yang S，Kim J，Ryu JH，et al.Hypoxiainducible factor2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction[J].Nat Med，2010，16（6）：687693.
[11]Muraki S，Oka H，Akune T，et al.Prevalence of radiographic knee osteoarthritis and its association with knee pain in the elderly of Japanese populationbased cohorts：the ROAD study[J].Osteoarthritis Cartilage，2009，17（9）：11371143.
[12]Pi Y，Zhang X，Shao Z，et al.Intraarticular delivery of antiHif2αsiRNA by chondrocytehoming nanoparticles to prevent cartilage degeneration in arthritic mice[J].Gene Ther，2015，22（6）：439448.
[13]Jaffe N.Osteosarcoma：review of the past，impact on the future.The American experience[J].Cancer Treat Res，2009（152）：239262.
[14]董富强.ADAMTS4、ADAMTS5在骨关节炎患者关节滑膜中的表达及意义[D].石河子：石河子大学，2014.
[15]Xu B，Sun Y，Tang G，et al.Id1 expression in
androgendependent prostate cancer is negatively regulated by androgen through androgen receptor[J].Cancer Lett，2009，278（2）：220229.
[16]McAllister SD，Murase R，Christian RT，et al.Pathways mediating the effects of cannabidiol on the reduction of breast cancer cell proliferation，invasion，and metastasis[J].Breast Cancer Res Treat，2011，129（1）：3747.
[17]Li J，Jia H，Xie L，et al.Correlation of inhibitor of differentiation 1 expression to tumor progression，poor differentiation and aggressive behaviors in cervical carcinoma[J].Gynecol Oncol，2009，114（1）：8993.
[18]Dai N，Zhong ZY，Cun YP，et al.Alteration of the microRNA expression profile in human osteosarcoma cells transfected with APE1 siRNA[J].Neoplasma，2013，60（4）：384394. [19]迭小红.siRNA沉默Id1基因对小鼠骨肉瘤细胞增殖、迁移及凋亡的影响[D].重庆：重庆医科大学，2014.
[20]陈健华，王欢.HSP75小干扰RNA对骨肉瘤细胞U2OS 增殖和迁移的影响[J].中国医科大学学报，2013，42（12）：11451147.
[21]Saito T，Fukai A，Mabuchi A，et al.Transcriptional regulation of endochondral ossification by HIF2alpha during skeletal growth and osteoarthritis development[J].Nat Med，
2010，16（6）：67886.
[22]仇超，康权，迭小红，等.Id1基因对人骨肉瘤细胞恶性逆转向成骨分化的影响[J].第三军医大学学报，2016，38（4）：344349.
[23]Stanton H，Rogerson FM，East CJ，et al.ADAMTS5 is the major aggrecanase in mouse cartilage in vivo and in
vitro[J].Nature，2005，434（7033）：648652.
[24]楚翔宇.慢病毒介导siRNAs沉默ADAMTS5基因治疗骨关节炎的实验研究[D].武汉：华中科技大学，2013.
[25]张智海，刘忠厚，李娜，等.中国人骨质疏松症诊断标准专家共识（第三稿?2014版）[J].中国骨质疏松杂志，2014，20（9）：10071010.
[26]Li J，Sarosi I，Cattley RC，et al.Dkk1mediated inhibition of Wnt signaling in bone results in osteopenia[J].Bone，2006，39（4）：754766.
[27]Heath DJ，Chantry AD，Buckle CH，et al.Inhibiting Dickkopf1 （Dkk1）removes suppression of bone formation and prevents the development of osteolytic bone disease in multiple myeloma[J].J Bone Miner Res，2009，24（3）：425336.
[28]刘媛，剧锦哲，张伟，等.DKK1siRNA真核表达载体的构建及其对骨质疏松大鼠治疗作用的研究[J].中国骨质疏
松杂志，2015，21（2）：125131，151.
[29]张新昌.CKIP1敲除对抗微重力环境下小鼠骨质疏松机理研究[D].北京：中国人民解放军军事医学科学院，2015.
[30]Guo B，Zhang B，Zheng L，et al.Therapeutic RNA interference targeting CKIP1 with a cross-species sequence to stimulate bone formation[J].Bone，2014（59）：7688.
[31]Jiang Y，Zhang Y，Zhang H，et al.Pravastatin prevents steroidinduced osteonecrosis in rats by suppressing PPARγexpression and activating Wnt signaling pathway[J].Exp Biol Med （Maywood），2014，239（3）：347355.
[32]Jiang Y，Liu D，Kong X，et al.Huogu I formula prevents steroidinduced osteonecrosis in rats by downregulating PPARgamma expression and activating wnt/LRP5/ betacatenin signaling[J].J Tradit Chin Med，2014，34（3）：342350.
[33]李劲峰.联合调控PPARγ及CGRP基因表达预防酒精性股骨头坏死的实验研究[D].郑州：郑州大学，2015.
（收稿日期：2016-03-08修回日期：2016-04-22）
（编辑：梁明佩）。