第五章 噬菌体与杂菌的防治

3．噬菌体污染的检查方法

(1)双层平板法(2)单层平板法


(3)载玻片快速法(4)液体培养检查法
(5)平板交叉划线法 (6)增殖检查法 (7)快速检测法(8)小剂量刺激检查法
三、控制噬菌体对谷氨酸发酵的危害

1.严格活菌体徘放，切断噬菌的“粮源” 噬菌体只能在活的、正处于生长繁殖阶
段的细胞中进行繁殖，而在死的、老的或休 眠状态的细胞中以及代谢产物上都不能繁殖。


⑦平板检查有噬菌斑，摇瓶检查发酵液清
稀。

⑧二级种子营养要求逐渐加多，种龄延长；
发酵周期逐罐延长，对生物素的要求越来
越大，产酸缓慢或下降；提取困难，收率
降低。

⑨送往等电提取车间的发酵掖，发红、发
灰、残糖高、有刺激臭味，泡沫大、粘度
大、难中和、中和时易出现9-型结晶、打
浆子，过滤困难，收率低。做出的谷氨酸
封闭。

③消灭设备死角。定期检查设备，尤其是
三级种子罐，罐顶、挡板、冷却管、罐底、
搅拌器、罐壁与节门等处有无死角、渗漏
及结垢，及时解决。设备要易于清洗与维
修。管路要简化，阀门要可靠，空压机应
选用无油润滑；发酵罐应定期去锈；防止
产生“浓胞”，以杜绝隐患。

④认真进行培养液、发酵设备、空气净化
系统及管路的消毒工作。
毒——噬菌体侵染所致。噬菌体对谷氨酸
发酵的危害，轻则减产，重则会引起发酵
液全部倒弃，造成严重损失。
一、噬菌体是什么？

噬菌体是病毒的一种，是一种极微小的生
物，体积是细菌的1／l，000左右，它可以
通过细菌过滤器，只有在电子显微镜下才
能看到。
其特性如下：
(1)从形态学角度，噬菌体分为六群：

1、2、3群有头部、尾部之分，为蝌蚪形； 4、5两群没有尾部，是微球形；6群为纤维 形噬菌体，是一条略呈弯曲的纤丝。日前，
体的发酵罐或种子罐，放罐前须加热至80-
100℃，杀死噬菌体后再往远处排放或送
往提取车间。

放罐后，空罐及各路管道消毒时加甲醛熏
蒸。有时还要煮罐，用PH11-13淡碱液搅
拌煮沸4-6小时，消除死角后，再用甲醛熏
蒸。

(5)对等电提取车间废弃的含菌母液也要加
强管理，不能乱撒，应通过密闭的阴沟向
与空压、发酵车间不同的方向远离排放。

味精厂的车间布置与一般化工厂不同，首
先考虑的是怎样布置才能减少未来生产中
的噬菌体污染，而不是省动力、省材料及
联系方便等，以免造成易受污染的“先天
性隐患”。


②吸风口高
据报道，美国有的味精厂为了确保进风的 洁净，采用40 m高的吸风口；日本有的味 精厂采用30m高的吸风口，效果很好。一 般的说，吸风口每高出10m，吸入空气中 的杂菌浓度便下降10的一次方。

噬菌体的繁殖过程可分为：
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
吸附---侵入(注入DNA)---复制---成熟---裂
解五步，寄生细胞裂解后释放出来的成熟
子代噬菌体随时又侵染其他细菌，开始新
的生活循环。
金属离子对噬菌体的影响：

已知钙、镁等二价金属离子能促进噬菌体 对谷氨酸生产菌的吸附、侵入，而Fe、cu 等重金属离子却会导致噬菌体失活；侵染

⑥棉花过滤器

空气过滤是防治噬菌体的—个重要关键，
种子罐必须采用分过滤器与总过滤器配合 使用，这样有一定阻截噬菌体的作用。最
好采用二只总过滤器并联装置，轮换使用。


⑦碱液罐
有的味精厂在空气净化系统中加装碱 液罐(3％NaoH，40℃)，使空压机压出的 空气先与碱液接触，气泡分散，保持一定 时间，以杀灭空气中的噬菌体，本法要格
就增加；

当空气中的噬菌体浓度上升到每个平板达
10-20PFu／mL(噬菌斑生成单位)时，二
级种子罐的噬菌体浓度为40-50PFU／mL；
之后迅速增加，达到100PFu／mL的程度，
终于在主发酵罐发生溶菌。

可见，经常测定谷氨酸发酵厂环境中，特
别是空气与种子罐二级种子液中的噬菌体
数，就能知道环境的噬菌体污染程度，也

现象。

③耗糖缓慢或停止；也有时出现睡眠病现 象，发酵缓慢，周期长，提取困难。 ④产生大量泡沫；发酵液粘度大，甚至呈 现粘胶状，可拔丝，发酵液发红、发灰； 有刺激气味。


⑤谷氨酸产量甚少，或增长极为缓慢，或 不产酸；也会出现产酸反而偏高或一段时 间内忽好忽坏。
⑥镜检时可发现菌体数量显著减少，菌体 不规则，缺乏八字排列，发圆；细胞核染 色，部分细胞核消失；革兰氏染色后，呈 现红色碎片；再严重时，拉丝、拉网，互 相堆在一起，呈鱼翅状或蜘蛛网状，完整 菌体很少。
尽管发酵后期污染也会呈现前期污染的很 多异常观象，尤其⑨⑩的异常现象，可是 由于不影响产酸，就常常不为发酵车间所 重视，这种忽视是要不得的，是可怕的。


这不仅是由于噬菌体的污染，致使醪液粘、 色素重、泡沫大，难于中和，难于过滤， 会严重影响等电点收率和谷氨酸质量。更 重要的是，如果不对后期污染进行必要的 善后处理，就会由后期染菌前移，造成更 严重的危害。
结晶，质量差、粘、色素深等；有时谷氨
酸成湿泥状、发粘等。

⑩精制中和时，色素深、泡沫大，碱加不 进去，过滤也有困难，过滤时间明显增加； 成品色重、透光差，收率低。
(3)发酵后期(12h以后)污染噬菌体

发酵后期污染噬菌体常对产酸影响不大， 甚至有时竞有提高产酸的趋势，这可能是 因为噬菌体对释放菌体中的部分谷氨酸有 积极作用。
菌时间能达数十秒，对杀死空气中的噬菌
体有明显作用。

⑤确保空气干燥

严格排油、水的操作，以确保进入棉
花过滤器的空气是干燥的；经常检查蒸汽 管路的阀门是否渗漏，防止因蒸汽阀门漏 水而使空气潮湿；为了确保空气干燥除菌， 可在棉花过滤器前加一预热器，预热空气 (60-70℃)并降低空气的相对湿度，效果很 好。
开一支安瓿（bu）或砂土管，效果较好。

③加强噬检工作。在厂外或厂内偏僻角落
建立噬检室。定期普查，掌握噬情，使防
治主动化。
（2）严格无菌操作

①加强种子室灭菌、无菌操作及安全卫生
措施。感染噬菌体的培养物不得带入无菌
室、摇瓶间(因噬菌体可透过纱布棉塞飞
扬），种子室应尽量减少与外界接触。

②二级种子接种时停风扇关门窗，用焰火


(3)净化空气
在谷氨酸发酵中，因为需要大量通入 空气，所以必须高度注意由空气而来的污 染。噬菌体在干燥状态比湿润状态稳定， 从空气中分离到的耐干燥的噬菌体，能长 时间(半年以上)存活而浮游于空气中，是 造成噬菌体污染的重要原因，要特别重视。
①合理的车间布置

味精厂的车间布置应使发酵、等电(或其它 方法的提取车间)、空压车间相互隔开，形 成三角形，尽量远离。
①不使用本身带有噬菌体的菌种。种子
纯化时，应以确保不带噬菌体为选种的主
要依据，不能只看产酸高低。经确认不是 溶源菌的生产用菌，要经常用双层琼脂平 板检查，保护生产用菌不受噬菌体感染。

②种子室与发酵车间分开、远离，使种子
工作不处于有噬菌体和杂苗污染的环境中，
以确保种子进行的第一环不染噬菌体。

如日本的味精厂，种子与工厂分开，每月
第五章 噬菌体与杂菌的防 治
第一节 谷氨酸发酵中噬菌体的污 染与防治
在谷氨酸发酵生产中，时常发生以 下情况：

发酵开始时，菌体生长良好，后来突然急
剧减少，短短几小时内，数10t发酵液中的
菌体全部被破坏，不再积累谷氨酸，往往
相随出现染菌，造成倒罐，甚至连续倒罐。
原因：

这是由于谷氨酸生产菌被一种微小的病
我国谷氨酸发酵中所发现的噬菌体，多属
蝌蚪形。
(2)具有非常专一的寄生性，只能在特异性寄 主细胞中增殖。

由于噬菌体缺乏独立代谢的酶体系，不能 脱离寄生而自行生长繁殖，因而噬菌体的 繁殖必须依存于寄生菌的繁殖，只能在活 的正在繁殖阶段的细胞中进行繁殖。
在死的、衰老的、处于休眠状态的细胞中 以及在代谢产物或培养基上都不能繁殖。
谷氨酸生产菌的噬菌体潜伏期多在60min
左右，裂解量为50至150之间。

(3)噬菌体没有细胞结构，为非细胞型生物， 主要由核酸和蛋白质构成。
(4)谷氨酸生产菌的噬菌体，一般在25-35℃、 PH5-9时较为稳定，易受热变性(60-70℃， 10-15Min)，对氧化物敏感，可被酸碱致死。

此外，凡能引起蛋白质变性的化学药品(如

③空气预过滤 经采风口吸入的空气，在未进空压机 前，应先经过几道粗滤，如杭州、宁波等
厂，吸入顶楼大房间中，经金属丝、玻璃
纤维棉及无纺布三道粗滤后才进入空压机，
对除菌和保护空压机均产生很好的效果，
染菌明显减少。

④空气加热 从空压机压出的空气可利用已有的温 度(一般130℃以上)保温灭菌，或先进一个 间接加热器再加热一下(150℃以上)，之后 用保温管道输送(100m左右)到一个大贮气 罐(100-200t)继续保温灭菌，若总保温灭

(3)车间四周、角落及楼周围不要乱堆东西， 要保持整齐、清洁，定期清扫、冲刷，撒 漂白粉或石灰等。 (4)车间地面和通往车间的道路尽量采取水 泥或沥清等光滑路面，避免用砖头、泥土、 砂石及炉渣等铺路，车间周围要尽量扩大 混凝土部分，以利冲洗、消毒。

3．严防噬菌体进入种子罐或发酵罐内

(1)种子
2．环境卫生，消灭噬菌体与杂菌

(1)建立工厂环境卫生制度，定期清扫，定
期消毒，定期检查。以发酵车间为中心， 包括空压与等电车间，设备外壁、地板、 天棚、四周及车间内外经常保持清洁，定 期使用药剂冲刷地面。对车间四周有严重 污染噬菌体的地点，应及时利用药剂或其 它方法处理。

(2)定期(每1—2周一次)用消毒灭菌剂喷雾， 消灭空气中的噬菌体与杂菌。如用次氯酸 钙烟雾剂、新洁尔灭、漂白粉液或氯化苄 叉毒芹稀释液喷雾等。喷雾地点除发酵车 间室内外之外，也应包括空压机房内外及 进风口周围等。
(1)二级种子污染噬菌体

二级种子0-3h感染噬菌体，泡沫大、pH高，
种子基本不长；6h以后感染噬菌体，泡沫
多、PH偏高，种子生长较差；轻度感染或
后期感染常看不出异常变化，可用快速检
测法，半小时就能确定是否污染噬菌体。
(2)发酵前期(0-12h）污染噬菌体

①光密度开始上升后下降、不升或回降， 甚至4-8h内oD值竞下降到零小时以下。 ②PH值逐渐上升，升到8．0以上，不再下 降；排气CO2一反常态，CO2迅速下降，相 继出现oD值下跌，PH上升、耗糖慢等异常
要密闭、集中起来，灭菌后再经管道或阴
沟向远处排放。切忌取样时连个接的桶也
没有，菌液四处飞溅，污染环境。

(3)徘气、发酵跑液要经管道集中于楼外的
密闭水封池中，或通入贮有药剂的容器设
备中经灭菌后通过管道或密闭阴沟向远处
排放，这一点很重要，必须引起高度重视。

(4)噬菌体不耐热，对甲醛敏感，感染噬菌
2．噬菌体严重污染的早期预报

(1)经定期测定空气与二级种子液中噬菌体 浓度的研究证明，空气中和二级种子罐培 养液中的噬菌体污染度是预防噬菌体的一 个措施。
噬菌体严重污染的演变过程

（1）在连续使用特定菌株进行谷氨酸发酵
时，首先是空气中的噬菌体浓度增加，数
月后种子罐的噬菌体浓度也急剧增加，随
之主发酵罐发酵液中的噬菌体检出浓度也
因此，如果我们能够不让活的谷氨酸生产
菌在环境中生长蔓延，也就切断了噬菌体
的食物来源，破坏了噬菌体的滋生场地和
繁殖条件。

(1)摇瓶液、测样后废液、洗罐后所废弃的
菌体、种子及带菌器皿洗涤水等，应集中 起来灭菌后再排放，严防不加任何处理的 随意排放，以杜绝隐患。

(2)取样液、试验后的废弃菌液或发酵液，
外加强油水分离，并要求常换碱液，以保
证碱液浓度与杀菌强度。
0.5％甲醛、 1％新洁尔灭、0.5%苯酚或漂
白粉等)都可使噬菌体失活。 但是值得注意的是，噬菌体在干燥状态比湿 润状态稳定，能长时间以活性状态浮游于空 气中，这是味精生产受噬菌体污染的一个重
要原因。
二、噬菌体侵染的异常现象与严重 污染的早期预报
1．噬菌体侵染的异常现象
谷氨酸发酵中污染噬菌体，由于侵染时间 和感染量的不同，以及噬菌体“毒力”和 菌株敏感性的差异，表现症状是不一样的， 一般会出现“二高三低”，即PH高、残糖 高；oD低、温度低、谷氨酸低。
就能预知主发酵罐中会不会发生噬菌体的
污染。
（2)发酵、等电及精制异常现象的 预报

噬菌体的污染需要积累到一定的浓度，才
会造成严重危害。实际上，在严重污染之 前，不论是发酵，还是等电提取与精制都 会出现很多异常现象，这是最好的预报。 根据这些预报，及早采取措施，我们就能 抢在噬菌体泛滥之前，扑灭它。