抗原抗体的纯化
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• 在物质的水溶液中添加一定浓度的中性 盐，使物质的溶解度减小而沉淀析出， 这一过程称为“盐析”。
抗原、抗体是免疫反应中最基本的物质因 素
2020/4/28
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4
抗原的纯化是制备高效价、高特异性抗体 的先决条件
抗体的纯化对提高免疫反应的特异性和敏 感性、定量检测抗原极为重要。
2020/4/28
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表3-1 分离纯化方法的比较
方法 离心分离法
盐析法 有机溶剂沉淀
法 凝胶层析法 离子交换法 亲和层析法
2020/4/28
19 19
第二节 沉淀分离
• 通过改变溶液的条件或添加某种物质， 降低溶液中某一成分的溶解度，使其从 溶液中沉淀析出，与其它成分分离的技 术。
• 是纯化生物大分子物质常用的经典方法 • 包括盐析沉淀法、有机溶剂沉淀法和非
离子聚合物沉淀法等。
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20 20
一、盐析法
离心时间时间过长或过短， 都会影响颗粒在离心管内的 预期位置，降低分离效果。
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16 16
（三）温度
• 为防止欲分离物质在离心过程中的聚集、变形 和失活，离心温度一般控制在4 ℃左右。
• 离心速度较低或者物质的耐热性较好，也可以 在室温条件下进行。
• 超速离心和高速离心，转子高速旋转会发热而 引起温度升高，必须采用冷冻系统。
免疫学检验
第三章 抗原抗体的纯化
广东药学院公共卫生学院 赵晓蓉
2020/百度文库/28
1
本章要求
• 掌握各种纯化方法的原理 • 熟悉各种纯化方法的影响因素 • 了解各种纯化方法的技术要点
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免疫学检验最重要的元素为抗原、抗体和 免疫细胞
免疫学检验最核心的部分为抗原抗体反应 (Antigen-antibody interaction)
• 需在沉淀中加入相同介质使沉淀悬浮，再 用较低转速离心，获得较纯的沉淀。
• 反复多次采用高速、低速离心操作，即可 获得较纯的组分。
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12 12
优点：操作简单、方便；
缺点：①分离效果较差，费时，不能一次得到纯品； ②管壁效应严重，特别当颗粒很大或浓度很高时，
沉淀出现在离心管壁一侧； ③颗粒被挤压，离心力过大和离心时间过长，都
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17 17
（四）pH
• 离心介质的pH必须是处于待分离物质稳定 的pH范围内，必要时可用缓冲溶液。
• pH过高或过低都可能引起生物活性物质的 变形、失活，还可能引起转子和离心机其 它部件的腐蚀，应加以注意。
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18 18
四、离心技术的应用
• 生物大分子的分离、浓缩和纯化
第一节 离心分离法
离心分离已成为科学研究中最基本的技术
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一、基本原理
• 离心法是利用旋转运动的离心力、物质的沉降系数和浮力 密度的差别进行分离的技术，当物质 的粒子以一定角速度 做圆周运动时，受到一个外向的离心力 。
（一）离心力 • 这种力的大小取决于角速度（ ，弧度/ ）和旋转半径，方
电泳
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原理
优点
缺点
应用
离心力和物质 沉降系数 操作简单 的差别
分辨率低
蛋白质分离
盐析作用
操作简单，成本低， 分辨率低，纯化 蛋白质的分级沉
重复性较好
倍数低
淀
脱水作用和降 低介电常 数
操作简单，分辨力 较强
对蛋白质有变性 蛋白质、多肽、
作用，成本
核酸和多糖
较高
的分级沉淀
分子筛的排阻 分辨力强，不引起
• （一）差速离心
（differential centrifugation）是指 采用不同的离心速度和离 心时间，用不同的离心力， 使不同沉降速度的颗粒分 批分离的方法。
• 差速离心主要用于分离大 小和密度差异较大的颗粒。
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11 11
• 差速离心法分离到的某一沉降物，纯度不 高，含有较多杂质。
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14 14
三、影响因素
离心机的种类、离心方法、离心介质以及密度梯度 （一）离心速度 • 低速离心一般用离心速度，即转子每分钟的转数表示，如
5000r/min等。 • 高速离心和超速离心时，往往以相对离心力（RCF）表示，
如60000×g等。 • 相对离心力是指颗粒所受到的离心力与地心引力之比值。
即：
RCF Fc 1.12105 n2 r Fg
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15 15
（二）离心时间
依据离心方法的不同，离心时间的概念也有差别。
• 常速离心、高速离心和差速离心的离心时间，是指颗粒从 离心管中样品液的液面完全沉降到管底的时间，即沉降时 间；
• 密度梯度离心的离心时间，是指形成界限分明的区带时间， 即区带形成时间；等密度梯度离心所需的离心时间，是指 颗粒完全到达等密度点的平衡时间，即平衡时间。
• 绝大多数生物分子的沉降系数都很小，将s乘 1013定义为一个沉降系数单位，用S（Svedberg） 表示，
• 一般S为20℃的纯水中待测物质的沉降系数。
S d 2 ( )1013 18
式中：d：沉降颗粒直径；δ：沉降颗粒密度；ρ：溶剂液体密 度；η：溶剂液体黏度；
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二、离心方法的类型
程式为：
F
mr
mr
2N
2
60
式中： ：沉降固体颗粒的有效质量（m）； ：离心半径，转子中心轴到沉降颗粒之间的距离(r)； ：离心机每分钟的转数（N ）。
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（二）沉降系数
• 受离心力作用的分子或颗粒，单位时间内运动的 距离称沉降速度。单位离心力作用下的沉降速度 称沉降系数，用s表示。
作用
蛋白质变性
离子基团的交 分辨力强，分离量
换作用
大
成本高 费时间，酸碱用
量大
分子质量有差别 的可溶性物 质
可电离的生化物 质
分离物与配体 间的亲和 分辨力很强 作用
一种配体只分离 一类物质， 生命大分子物质 局限性大
物质的带电性 设备简单、操作方
质
便、分辨率高
成本高
生物分子的分离、 定性、定量
6 6
会使颗粒变形、聚集而失活。
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（二）密度梯度离心
• （density gradient centrifugation）是样 品在密度梯度介质中进行离心，适于分离密度 相近而大小不同的物质。
（三）等密度梯度离心
• （isopycnic gradient centrifugation）适 于分离大小相同而密度不同的物质。
抗原、抗体是免疫反应中最基本的物质因 素
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抗原的纯化是制备高效价、高特异性抗体 的先决条件
抗体的纯化对提高免疫反应的特异性和敏 感性、定量检测抗原极为重要。
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表3-1 分离纯化方法的比较
方法 离心分离法
盐析法 有机溶剂沉淀
法 凝胶层析法 离子交换法 亲和层析法
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第二节 沉淀分离
• 通过改变溶液的条件或添加某种物质， 降低溶液中某一成分的溶解度，使其从 溶液中沉淀析出，与其它成分分离的技 术。
• 是纯化生物大分子物质常用的经典方法 • 包括盐析沉淀法、有机溶剂沉淀法和非
离子聚合物沉淀法等。
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一、盐析法
离心时间时间过长或过短， 都会影响颗粒在离心管内的 预期位置，降低分离效果。
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（三）温度
• 为防止欲分离物质在离心过程中的聚集、变形 和失活，离心温度一般控制在4 ℃左右。
• 离心速度较低或者物质的耐热性较好，也可以 在室温条件下进行。
• 超速离心和高速离心，转子高速旋转会发热而 引起温度升高，必须采用冷冻系统。
免疫学检验
第三章 抗原抗体的纯化
广东药学院公共卫生学院 赵晓蓉
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本章要求
• 掌握各种纯化方法的原理 • 熟悉各种纯化方法的影响因素 • 了解各种纯化方法的技术要点
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免疫学检验最重要的元素为抗原、抗体和 免疫细胞
免疫学检验最核心的部分为抗原抗体反应 (Antigen-antibody interaction)
• 需在沉淀中加入相同介质使沉淀悬浮，再 用较低转速离心，获得较纯的沉淀。
• 反复多次采用高速、低速离心操作，即可 获得较纯的组分。
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优点：操作简单、方便；
缺点：①分离效果较差，费时，不能一次得到纯品； ②管壁效应严重，特别当颗粒很大或浓度很高时，
沉淀出现在离心管壁一侧； ③颗粒被挤压，离心力过大和离心时间过长，都
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（四）pH
• 离心介质的pH必须是处于待分离物质稳定 的pH范围内，必要时可用缓冲溶液。
• pH过高或过低都可能引起生物活性物质的 变形、失活，还可能引起转子和离心机其 它部件的腐蚀，应加以注意。
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四、离心技术的应用
• 生物大分子的分离、浓缩和纯化
第一节 离心分离法
离心分离已成为科学研究中最基本的技术
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一、基本原理
• 离心法是利用旋转运动的离心力、物质的沉降系数和浮力 密度的差别进行分离的技术，当物质 的粒子以一定角速度 做圆周运动时，受到一个外向的离心力 。
（一）离心力 • 这种力的大小取决于角速度（ ，弧度/ ）和旋转半径，方
电泳
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原理
优点
缺点
应用
离心力和物质 沉降系数 操作简单 的差别
分辨率低
蛋白质分离
盐析作用
操作简单，成本低， 分辨率低，纯化 蛋白质的分级沉
重复性较好
倍数低
淀
脱水作用和降 低介电常 数
操作简单，分辨力 较强
对蛋白质有变性 蛋白质、多肽、
作用，成本
核酸和多糖
较高
的分级沉淀
分子筛的排阻 分辨力强，不引起
• （一）差速离心
（differential centrifugation）是指 采用不同的离心速度和离 心时间，用不同的离心力， 使不同沉降速度的颗粒分 批分离的方法。
• 差速离心主要用于分离大 小和密度差异较大的颗粒。
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• 差速离心法分离到的某一沉降物，纯度不 高，含有较多杂质。
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三、影响因素
离心机的种类、离心方法、离心介质以及密度梯度 （一）离心速度 • 低速离心一般用离心速度，即转子每分钟的转数表示，如
5000r/min等。 • 高速离心和超速离心时，往往以相对离心力（RCF）表示，
如60000×g等。 • 相对离心力是指颗粒所受到的离心力与地心引力之比值。
即：
RCF Fc 1.12105 n2 r Fg
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（二）离心时间
依据离心方法的不同，离心时间的概念也有差别。
• 常速离心、高速离心和差速离心的离心时间，是指颗粒从 离心管中样品液的液面完全沉降到管底的时间，即沉降时 间；
• 密度梯度离心的离心时间，是指形成界限分明的区带时间， 即区带形成时间；等密度梯度离心所需的离心时间，是指 颗粒完全到达等密度点的平衡时间，即平衡时间。
• 绝大多数生物分子的沉降系数都很小，将s乘 1013定义为一个沉降系数单位，用S（Svedberg） 表示，
• 一般S为20℃的纯水中待测物质的沉降系数。
S d 2 ( )1013 18
式中：d：沉降颗粒直径；δ：沉降颗粒密度；ρ：溶剂液体密 度；η：溶剂液体黏度；
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二、离心方法的类型
程式为：
F
mr
mr
2N
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式中： ：沉降固体颗粒的有效质量（m）； ：离心半径，转子中心轴到沉降颗粒之间的距离(r)； ：离心机每分钟的转数（N ）。
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（二）沉降系数
• 受离心力作用的分子或颗粒，单位时间内运动的 距离称沉降速度。单位离心力作用下的沉降速度 称沉降系数，用s表示。
作用
蛋白质变性
离子基团的交 分辨力强，分离量
换作用
大
成本高 费时间，酸碱用
量大
分子质量有差别 的可溶性物 质
可电离的生化物 质
分离物与配体 间的亲和 分辨力很强 作用
一种配体只分离 一类物质， 生命大分子物质 局限性大
物质的带电性 设备简单、操作方
质
便、分辨率高
成本高
生物分子的分离、 定性、定量
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会使颗粒变形、聚集而失活。
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（二）密度梯度离心
• （density gradient centrifugation）是样 品在密度梯度介质中进行离心，适于分离密度 相近而大小不同的物质。
（三）等密度梯度离心
• （isopycnic gradient centrifugation）适 于分离大小相同而密度不同的物质。