动物细胞与组织培养干细胞
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华侨大学 生物工程系 刘建福 15
ES细胞的调控
• ES细胞的调控是指给出适当的因子条件，对ES细胞的增殖和分 化进行调控，使之向指定的方向发展。 • 一 内源性调控
• 1 细胞内蛋白对ES细胞分裂的调控 • ES细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不 对称性是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。 细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分，对细胞的发育非常重要。 • 2 转录因子的调控 • 脊椎动物中转录因子对干细胞分化的调节非常重要。胚胎干细胞的 发生中，转录因子OCT4是必需的。 OCT4缺失突变的胚胎只能发育 到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。白血病抑制因子 （LIF）对培养的小鼠ES细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体 干细胞无作用，说明不同属间的转录调控是不完全一致的。
• ES细胞：当受精卵分裂发育至囊胚期，胚胎细胞在囊胚腔内成团 存在，称为内细胞团（inner cell mass）。将细胞团的细胞分离出 来进行培养，在一定条件下这些细胞可在体外“无限期”地增殖 传代，同时还保持其全能性。 • EG细胞是由原始生殖细胞（primordial germ cell, PGC）培养分 离得到。 • ES是一种高度分化细胞，具有发育的全能性，能分化出成体动物 的所有组织和器官，包括生殖细胞。
华侨大学 生物工程系 刘建福 12
• 胚胎干细胞的生物学特征：
– a．形态学特征 在培养基中，圆形或卵圆形的细胞单层或多 层堆积，呈岛状或巢状，细胞界限不清楚；细胞体积小，核 大，胞浆少，有一个或多个核仁。 – b．发育全能性标志 具有发育阶段特异性胚胎抗原（stagespecific embryonic antigen，SSEA）；碱性磷酸酶（ AKP） 活性较高；OCT-4基因表达，OCT-4基因是一种发育全能性的 标志基因；端粒酶活性很高。
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胚胎干细胞的生物学特性（P142－143） 1 ES细胞形态结构与核型 2 ES细胞的生长特性 3 ES细胞的高度分化潜能
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14ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
ES细胞的全能性表现：
1 形成畸胚瘤，将ES细胞注入同源动物皮下可形成畸胚瘤， 包括三个胚层细胞。 2 形成类胚体，将ES细胞在非黏附底物中悬浮培养生长，或 控制增殖细胞数目，能够生成类胚体，是一个与畸胚瘤相 似的多种系混杂的集合体，具有三个胚层组织。 3 直系分化，通过控制ES细胞生长环境或遗传操纵特定基因 表达， ES细胞可直接分化成某特定种系细胞。如NeuroD2 和NeuroD3转入ES细胞可分化为神经细胞。 4 形成嵌合体，将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以 形成嵌合体。
胚胎干细胞
造血干细胞 神经干细胞
间充质干细胞
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干细胞的有关特性
一、形态和生化特征
• 形态上通常呈圆形或椭圆形、体积小、核质比例较大
• 干细胞具有较高的端粒酶活性，具有较强的增殖能力 二、增殖 • 缓慢性－－利于细胞对特定的外界信号作出反应，以 决定进行增殖还是进入特定的分化程序。还可减少基 因发生突变的可能性。 • 自稳性－－干细胞自我更新维持自身数目的恒定。这 是干细胞区别于肿瘤细胞的本质特征。
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三、分化潜能与干细胞的种类
干细胞（stem cell）是一类具有自我复制能力（selfrenewing）的多潜能细胞，它可以分化成多种功能细胞。
– 根据其发育阶段，可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。
– 根据其分化潜能的大小，可分为：
① 全能干细胞。它具有形成完整个体的分化潜能，可以无限制 地增殖，能分化成成体的200多种细胞类型，从而可以形成任 何组织和器官。胚胎干细胞属于此类。 ② 多能干细胞。它具有分化成多种细胞组织的潜能，但却失去 了发育成完整个体的能力，如间充质干细胞。 ③ 定向干细胞。只能向一种或密切相关的细胞类型分化，如造 血干细胞和神经干细胞等。
• ES细胞可以在体外培养成为永久性细胞系，人们可以在体外对其 进行各种遗传操作，通过核移植技术生产转基因动物。
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胚胎干细胞
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10
胚胎干细胞的研究概况
• 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是已知的分化潜能最广的 一类干细胞。 • 胚胎干细胞的研究历史可以追溯到1958年，Stevens等将小鼠附 植体胚胎异位移植到肾脏的被膜下，得到一种能够连续传代的多 潜能细胞系，称为胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cell）或畸 胎瘤（teratocarcinoma cell），简称EC细胞。 • 胚胎干细胞系建立于1981年。英国剑桥大学的 Evans和 Kaufman， 美国加州大学的Martin分别成功地分离和体外培养了小鼠的胚胎 干细胞。此后，一系列其它动物的胚胎干细胞相继分离和建系， 如金黄地鼠、大鼠（1988）、猪（1990）、牛（1992）、水貂和 兔（1993）等。 • 1995年Thomson等从恒河猴的囊胚中分离建立了世界上第一株灵 长类动物的胚胎干细胞。 11 华侨大学 生物工程系 刘建福
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干 细 胞
华侨大学 生物工程系 刘建福
4
华侨大学 生物工程系 刘建福
5
干细胞的分裂
华侨大学 生物工程系 刘建福
6
正常干细胞发育
华侨大学 生物工程系 刘建福
7
华侨大学 生物工程系 刘建福
8
胚胎干细胞
• 胚胎干细胞包括ES细胞（embryonic stem cell）和EG细胞 （embryonic germ cell）。
• 1998年他们在建立灵长类胚胎干细胞取得成 功的经验基础上，从接受不孕症治疗的夫妇 所捐赠的处于囊胚阶段的早期胚胎中分离出 人的ES细胞。同年，Gearhart从选择性流产所 得到的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞。 • 2000年，澳大利亚的Reubinoff和新加坡的体 外受精专家合作，又成功地从人胚泡中建立 了8株未分化的人胚胎干细胞，并在体外分化 实验中成功地得到了神经干细胞。
ES细胞的调控
• ES细胞的调控是指给出适当的因子条件，对ES细胞的增殖和分 化进行调控，使之向指定的方向发展。 • 一 内源性调控
• 1 细胞内蛋白对ES细胞分裂的调控 • ES细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不 对称性是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。 细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分，对细胞的发育非常重要。 • 2 转录因子的调控 • 脊椎动物中转录因子对干细胞分化的调节非常重要。胚胎干细胞的 发生中，转录因子OCT4是必需的。 OCT4缺失突变的胚胎只能发育 到囊胚期，其内部细胞不能发育成内层细胞团。白血病抑制因子 （LIF）对培养的小鼠ES细胞的自我更新有促进作用，而对人的成体 干细胞无作用，说明不同属间的转录调控是不完全一致的。
• ES细胞：当受精卵分裂发育至囊胚期，胚胎细胞在囊胚腔内成团 存在，称为内细胞团（inner cell mass）。将细胞团的细胞分离出 来进行培养，在一定条件下这些细胞可在体外“无限期”地增殖 传代，同时还保持其全能性。 • EG细胞是由原始生殖细胞（primordial germ cell, PGC）培养分 离得到。 • ES是一种高度分化细胞，具有发育的全能性，能分化出成体动物 的所有组织和器官，包括生殖细胞。
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• 胚胎干细胞的生物学特征：
– a．形态学特征 在培养基中，圆形或卵圆形的细胞单层或多 层堆积，呈岛状或巢状，细胞界限不清楚；细胞体积小，核 大，胞浆少，有一个或多个核仁。 – b．发育全能性标志 具有发育阶段特异性胚胎抗原（stagespecific embryonic antigen，SSEA）；碱性磷酸酶（ AKP） 活性较高；OCT-4基因表达，OCT-4基因是一种发育全能性的 标志基因；端粒酶活性很高。
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胚胎干细胞的生物学特性（P142－143） 1 ES细胞形态结构与核型 2 ES细胞的生长特性 3 ES细胞的高度分化潜能
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ES细胞的全能性表现：
1 形成畸胚瘤，将ES细胞注入同源动物皮下可形成畸胚瘤， 包括三个胚层细胞。 2 形成类胚体，将ES细胞在非黏附底物中悬浮培养生长，或 控制增殖细胞数目，能够生成类胚体，是一个与畸胚瘤相 似的多种系混杂的集合体，具有三个胚层组织。 3 直系分化，通过控制ES细胞生长环境或遗传操纵特定基因 表达， ES细胞可直接分化成某特定种系细胞。如NeuroD2 和NeuroD3转入ES细胞可分化为神经细胞。 4 形成嵌合体，将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以 形成嵌合体。
胚胎干细胞
造血干细胞 神经干细胞
间充质干细胞
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干细胞的有关特性
一、形态和生化特征
• 形态上通常呈圆形或椭圆形、体积小、核质比例较大
• 干细胞具有较高的端粒酶活性，具有较强的增殖能力 二、增殖 • 缓慢性－－利于细胞对特定的外界信号作出反应，以 决定进行增殖还是进入特定的分化程序。还可减少基 因发生突变的可能性。 • 自稳性－－干细胞自我更新维持自身数目的恒定。这 是干细胞区别于肿瘤细胞的本质特征。
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三、分化潜能与干细胞的种类
干细胞（stem cell）是一类具有自我复制能力（selfrenewing）的多潜能细胞，它可以分化成多种功能细胞。
– 根据其发育阶段，可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。
– 根据其分化潜能的大小，可分为：
① 全能干细胞。它具有形成完整个体的分化潜能，可以无限制 地增殖，能分化成成体的200多种细胞类型，从而可以形成任 何组织和器官。胚胎干细胞属于此类。 ② 多能干细胞。它具有分化成多种细胞组织的潜能，但却失去 了发育成完整个体的能力，如间充质干细胞。 ③ 定向干细胞。只能向一种或密切相关的细胞类型分化，如造 血干细胞和神经干细胞等。
• ES细胞可以在体外培养成为永久性细胞系，人们可以在体外对其 进行各种遗传操作，通过核移植技术生产转基因动物。
华侨大学 生物工程系 刘建福 9
胚胎干细胞
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胚胎干细胞的研究概况
• 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是已知的分化潜能最广的 一类干细胞。 • 胚胎干细胞的研究历史可以追溯到1958年，Stevens等将小鼠附 植体胚胎异位移植到肾脏的被膜下，得到一种能够连续传代的多 潜能细胞系，称为胚胎癌细胞（embryonic carcinoma cell）或畸 胎瘤（teratocarcinoma cell），简称EC细胞。 • 胚胎干细胞系建立于1981年。英国剑桥大学的 Evans和 Kaufman， 美国加州大学的Martin分别成功地分离和体外培养了小鼠的胚胎 干细胞。此后，一系列其它动物的胚胎干细胞相继分离和建系， 如金黄地鼠、大鼠（1988）、猪（1990）、牛（1992）、水貂和 兔（1993）等。 • 1995年Thomson等从恒河猴的囊胚中分离建立了世界上第一株灵 长类动物的胚胎干细胞。 11 华侨大学 生物工程系 刘建福
华侨大学 生物工程系 刘建福 3
干 细 胞
华侨大学 生物工程系 刘建福
4
华侨大学 生物工程系 刘建福
5
干细胞的分裂
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6
正常干细胞发育
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7
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8
胚胎干细胞
• 胚胎干细胞包括ES细胞（embryonic stem cell）和EG细胞 （embryonic germ cell）。
• 1998年他们在建立灵长类胚胎干细胞取得成 功的经验基础上，从接受不孕症治疗的夫妇 所捐赠的处于囊胚阶段的早期胚胎中分离出 人的ES细胞。同年，Gearhart从选择性流产所 得到的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞。 • 2000年，澳大利亚的Reubinoff和新加坡的体 外受精专家合作，又成功地从人胚泡中建立 了8株未分化的人胚胎干细胞，并在体外分化 实验中成功地得到了神经干细胞。