iTRAQ技术对卵巢癌早期筛查诊断的蛋白质磷酸化修饰的研究
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稳定同位素标记技术在定量准确度和规模化定量分析方面 都有很大的应用前景。这种方法既可以研究全蛋白质组的变化, 也可以结合磷酸化肽段的富集技术和串联质谱技术对磷酸化肽 段进行定量研究。目前,可用于肽段定量研究的iTRAQ、iCAT等 技术同样可用于磷酸化肽段的研究。
研究背景
我们为什么选择iTRAQ技术？
基本思路和方法
3、二氧化钛富集磷酸化肽段：
称取1mg TiO2放入50% ACN/0.1% FA( 40μL)中，制成匀浆液，装入GELoader 枪头中，用惰 性材料塞紧。装好的微柱依次用40μL的0．1% FA， 80% ACN/0.1% TFA，40μL ×2的300 mmol /L LA/80% ACN/0.1% FA的溶液冲洗，将样品注入微 柱中，依次用40μL× 2 的300 mmol /L LA/80% ACN/0.1% FA，40μL 80% ACN/0.1% TFA， 40μL H2O 洗脱，最后用10μL×2 的5% NH3·H2O 收集，并用甲酸调至pH 3；称取1 mg C18-AQ 材料装 柱( 同上),将装好的微柱依次用40μL ACN，40μL× 2 的50% ACN/0.1% FA 溶液冲洗，再用40μL × 2 的 0.1% FA 溶液平衡微柱，将上述富集到的收集液上样， 再用40μL× 2 的0.1% FA 溶液脱盐，最后用20μL× 2 的50%ACN/0.1%FA 溶液洗脱收集并旋干，再用 10μL的50% ACN/0.1% FA 溶解；
2）蛋白定量标记：1.2 mL的预冷丙酮加入300μL低丰度蛋白血清，见 沉淀物形成。4℃ 15 000 g离心100 min，弃上清，沉淀室温放置20 min使丙酮挥发完全。然后加入20μL溶解缓冲液充分混匀，使样品充分 溶解。每组样品取100μg，加入2倍体积的还原剂，充分混合，60℃孵 育1 h。管内加入半胱氨酸封闭剂涡旋混合后室温孵育10min。按 1∶30（胰酶∶蛋白质）的比例向样品管内加入消化酶，涡旋混合， 37℃孵育16 h。iTRAQ试剂室温冻融，每管iTRAQ试剂加入70μL无 水乙醇，涡旋混合，使之溶解后转入样品管。然后按照卵巢癌组加入质量 数118Da和正常对照组119Da的标记分别加入样品管，漩涡混匀，室 温孵育1 h，真空冷冻干燥，去除标记中的胰蛋白酶和未标记的多肽；
iTRAQ技术是一种新的、功能强大的可同时对多种样品 进行绝对和相对定量研究的方法，可以标记生物样品中产 生的所有肽段，增强任一给定蛋白的肽段覆盖度，同时保 留了诸如一些蛋白的翻译后修饰的重要结构信息，可以实 现在二级图谱上的定量，具体原理已有详细报道，但目前 有关iTRAQ 在磷酸化蛋白质定量方面的研究报道还很少。
1）去除高丰度蛋白：每组样品先取10例冰上解冻。等体积混合得到混合 血清。从中取20μL，用缓冲液A各稀释4倍。加入0.22μm的离心过滤 器4 ℃ 16 000g离心1min，去除血清中碎片成分。取稀释血清80μL ，进行LC分离，流速0.125mL/min，在11～16 min收集低丰度蛋 白的流出组分。采用Bradord试剂盒检测馏分蛋白浓度。其余样本80℃保存待用。
尽管人类基因组包含了机体的所有遗传信息, 但其只是指导蛋白 质合成，而构成细胞并发挥各种功能作用则是由蛋白质来完成，蛋 白质还是机体多种不同类型细胞之间差异的决定因素。同样, 肿瘤细 胞和正常细胞的差异在很大程度上也是由功能基因及其指导合成的 蛋白质组的不同来决定的。因此，有必要从蛋白质组水平来揭示肿 瘤的发生机制。
这种方法是建立在iTRAQ试剂的基础上。iTRAQ实际上 是一种同位素标记试剂包括一个带电荷的报告基团，另外 还有一个肽段反应基团和一个平衡基团。
主要观点和创新之处
目前，国内外对于卵巢癌的早期筛查/诊断尚缺乏有效 方法和特异性的肿瘤标志物。我们本次实验意在通过对卵巢 癌蛋白质组学研究，或得出正常卵巢和癌变卵巢表达蛋白的 差异。
iTRAQ技术对卵巢癌早期筛查/诊断的蛋白 质磷酸化修饰的研究
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研究背景
卵巢癌的研究现状 目前最普遍使用的卵巢癌生物标记物是肿瘤抗原CA125,尽管
80%的晚期卵巢癌病人CA125浓度不正常,但是50% ～60%的Ⅰ 期卵巢癌病人CA125 浓度增高。CA125 作为标记物的阳性预测值 不到10%。因此,需要寻找特异性更强和灵敏度更高的肿瘤分子标记 物。 蛋白质组学的新进展
基本思路和方法
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基本思路和方法
1、血清来源:
选取医院经病理证实为卵巢恶性肿瘤患者晨 空腹血清20份，年龄33～70岁，设为卵巢癌组 ；经体检无任何疾病的健康人群晨空腹血清20份 ，设为正常对照组。所采集的血清标本保存于80℃冰箱；
基本思路和方法
2、血清差异蛋白筛选：
蛋白质组学可全面、动态、定量地分析比较正常与癌变标本中蛋 白质种类和数量的改变,不仅有助于肿瘤发病机制的阐明,还能筛选和 鉴定蛋白质特异性标记和特异性抗原,在肿瘤的早期诊断、治疗和新 药研制方面,具有广阔的应用前景。
wenku.baidu.com
研究背景
蛋白质的磷酸化修饰
蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一是生物 界最普遍也是最重要的一种蛋白质翻译后修饰。磷酸化的失调会导致 很多严重的人类疾病，如癌症。磷酸化蛋白质检测技术用于卵巢癌研 究中，有利于寻找卵巢癌诊断和治疗的靶点。目前，磷酸化蛋白质组 学在定量研究方面多采用32P代谢标记、荧光染料染色的磷酸化蛋白 质定量分析方法、同位素标记技术等。对于图谱创建中许多磷酸化调 控蛋白呈低丰度状况, 蛋白质鉴定技术敏感性的提高将是克服这一障 碍的关键。随着样本制备技术和仪器设备的迅速发展, 更好的富集策 略和磷酸化定量两大难点将会不断得到克服, 蛋白磷酸化位点的鉴定 和定位技术也更易开展
基于iTRAQ +蛋白组学研究+蛋白磷酸化修饰的差异 基于iTRAQ 标记结合质谱技术筛选卵巢癌血清标记物 在国内虽有学者研究，但还没有突破性的成果。我们发现国 内外尚无学者研究卵巢癌表达蛋白磷酸化修饰的差异，我们 此次通过研究卵巢癌表达蛋白磷酸化修饰的差异或得出正常 卵巢和癌变卵巢表达蛋白的磷酸化修饰是否存在差异。从而 寻找用于卵巢癌早期诊断的血清肿瘤标志物提供了一定的临 床前期研究基础。之所以选择磷酸化修饰作为研究对象，是 因为蛋白质磷酸化是最常见，也是最重要的一种蛋白翻译后 修饰方式。蛋白质的磷酸化在真核生物的信号转导中具有很 重要的作用。
研究背景
我们为什么选择iTRAQ技术？
基本思路和方法
3、二氧化钛富集磷酸化肽段：
称取1mg TiO2放入50% ACN/0.1% FA( 40μL)中，制成匀浆液，装入GELoader 枪头中，用惰 性材料塞紧。装好的微柱依次用40μL的0．1% FA， 80% ACN/0.1% TFA，40μL ×2的300 mmol /L LA/80% ACN/0.1% FA的溶液冲洗，将样品注入微 柱中，依次用40μL× 2 的300 mmol /L LA/80% ACN/0.1% FA，40μL 80% ACN/0.1% TFA， 40μL H2O 洗脱，最后用10μL×2 的5% NH3·H2O 收集，并用甲酸调至pH 3；称取1 mg C18-AQ 材料装 柱( 同上),将装好的微柱依次用40μL ACN，40μL× 2 的50% ACN/0.1% FA 溶液冲洗，再用40μL × 2 的 0.1% FA 溶液平衡微柱，将上述富集到的收集液上样， 再用40μL× 2 的0.1% FA 溶液脱盐，最后用20μL× 2 的50%ACN/0.1%FA 溶液洗脱收集并旋干，再用 10μL的50% ACN/0.1% FA 溶解；
2）蛋白定量标记：1.2 mL的预冷丙酮加入300μL低丰度蛋白血清，见 沉淀物形成。4℃ 15 000 g离心100 min，弃上清，沉淀室温放置20 min使丙酮挥发完全。然后加入20μL溶解缓冲液充分混匀，使样品充分 溶解。每组样品取100μg，加入2倍体积的还原剂，充分混合，60℃孵 育1 h。管内加入半胱氨酸封闭剂涡旋混合后室温孵育10min。按 1∶30（胰酶∶蛋白质）的比例向样品管内加入消化酶，涡旋混合， 37℃孵育16 h。iTRAQ试剂室温冻融，每管iTRAQ试剂加入70μL无 水乙醇，涡旋混合，使之溶解后转入样品管。然后按照卵巢癌组加入质量 数118Da和正常对照组119Da的标记分别加入样品管，漩涡混匀，室 温孵育1 h，真空冷冻干燥，去除标记中的胰蛋白酶和未标记的多肽；
iTRAQ技术是一种新的、功能强大的可同时对多种样品 进行绝对和相对定量研究的方法，可以标记生物样品中产 生的所有肽段，增强任一给定蛋白的肽段覆盖度，同时保 留了诸如一些蛋白的翻译后修饰的重要结构信息，可以实 现在二级图谱上的定量，具体原理已有详细报道，但目前 有关iTRAQ 在磷酸化蛋白质定量方面的研究报道还很少。
1）去除高丰度蛋白：每组样品先取10例冰上解冻。等体积混合得到混合 血清。从中取20μL，用缓冲液A各稀释4倍。加入0.22μm的离心过滤 器4 ℃ 16 000g离心1min，去除血清中碎片成分。取稀释血清80μL ，进行LC分离，流速0.125mL/min，在11～16 min收集低丰度蛋 白的流出组分。采用Bradord试剂盒检测馏分蛋白浓度。其余样本80℃保存待用。
尽管人类基因组包含了机体的所有遗传信息, 但其只是指导蛋白 质合成，而构成细胞并发挥各种功能作用则是由蛋白质来完成，蛋 白质还是机体多种不同类型细胞之间差异的决定因素。同样, 肿瘤细 胞和正常细胞的差异在很大程度上也是由功能基因及其指导合成的 蛋白质组的不同来决定的。因此，有必要从蛋白质组水平来揭示肿 瘤的发生机制。
这种方法是建立在iTRAQ试剂的基础上。iTRAQ实际上 是一种同位素标记试剂包括一个带电荷的报告基团，另外 还有一个肽段反应基团和一个平衡基团。
主要观点和创新之处
目前，国内外对于卵巢癌的早期筛查/诊断尚缺乏有效 方法和特异性的肿瘤标志物。我们本次实验意在通过对卵巢 癌蛋白质组学研究，或得出正常卵巢和癌变卵巢表达蛋白的 差异。
iTRAQ技术对卵巢癌早期筛查/诊断的蛋白 质磷酸化修饰的研究
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研究背景
卵巢癌的研究现状 目前最普遍使用的卵巢癌生物标记物是肿瘤抗原CA125,尽管
80%的晚期卵巢癌病人CA125浓度不正常,但是50% ～60%的Ⅰ 期卵巢癌病人CA125 浓度增高。CA125 作为标记物的阳性预测值 不到10%。因此,需要寻找特异性更强和灵敏度更高的肿瘤分子标记 物。 蛋白质组学的新进展
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基本思路和方法
1、血清来源:
选取医院经病理证实为卵巢恶性肿瘤患者晨 空腹血清20份，年龄33～70岁，设为卵巢癌组 ；经体检无任何疾病的健康人群晨空腹血清20份 ，设为正常对照组。所采集的血清标本保存于80℃冰箱；
基本思路和方法
2、血清差异蛋白筛选：
蛋白质组学可全面、动态、定量地分析比较正常与癌变标本中蛋 白质种类和数量的改变,不仅有助于肿瘤发病机制的阐明,还能筛选和 鉴定蛋白质特异性标记和特异性抗原,在肿瘤的早期诊断、治疗和新 药研制方面,具有广阔的应用前景。
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蛋白质的磷酸化修饰
蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一是生物 界最普遍也是最重要的一种蛋白质翻译后修饰。磷酸化的失调会导致 很多严重的人类疾病，如癌症。磷酸化蛋白质检测技术用于卵巢癌研 究中，有利于寻找卵巢癌诊断和治疗的靶点。目前，磷酸化蛋白质组 学在定量研究方面多采用32P代谢标记、荧光染料染色的磷酸化蛋白 质定量分析方法、同位素标记技术等。对于图谱创建中许多磷酸化调 控蛋白呈低丰度状况, 蛋白质鉴定技术敏感性的提高将是克服这一障 碍的关键。随着样本制备技术和仪器设备的迅速发展, 更好的富集策 略和磷酸化定量两大难点将会不断得到克服, 蛋白磷酸化位点的鉴定 和定位技术也更易开展
基于iTRAQ +蛋白组学研究+蛋白磷酸化修饰的差异 基于iTRAQ 标记结合质谱技术筛选卵巢癌血清标记物 在国内虽有学者研究，但还没有突破性的成果。我们发现国 内外尚无学者研究卵巢癌表达蛋白磷酸化修饰的差异，我们 此次通过研究卵巢癌表达蛋白磷酸化修饰的差异或得出正常 卵巢和癌变卵巢表达蛋白的磷酸化修饰是否存在差异。从而 寻找用于卵巢癌早期诊断的血清肿瘤标志物提供了一定的临 床前期研究基础。之所以选择磷酸化修饰作为研究对象，是 因为蛋白质磷酸化是最常见，也是最重要的一种蛋白翻译后 修饰方式。蛋白质的磷酸化在真核生物的信号转导中具有很 重要的作用。