最新酶促反应动力学实验资料

酶动力学综合实验

实验（一）一一碱性磷酸酶Km直的测定

【目的要求】

i. 了解底物浓度对酶促反应速度的影响

2•了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km值的方法。

【实验原理】

1、碱性磷酸酶：

碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。

2、米氏方程：

Michaelis-Menten在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反

应动力学的基本公式，即：

式中：v表示酶促反应速度，

車表示酶促反应最大速度,

［S］表示底物浓

度，表示米氏常

数。

3、•值的测定主要采用图解法，有以下四种：

①双曲线作图法（图1-1, a）

根据公式（1），以v对［s］作图，此时1/2%肚时的底物浓度［s］值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测—个近似值，因而1/2 一不精确。此外由于v对［S］的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。

②Lin eweaver- Burk作图法双倒数作图法（图1-1，b）

实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。其中之一即取（1）式的倒数，变换为Lin eweaver- Burk方程式：

以対…作图，即为y=ax+b 形式。此时斜率为丄，纵截距为

丄。把直线外推与 u [jj %

横轴相交，其截距相交，其截距即为一

③ Hofstee 作图法（略）

Vmax 卩址1丄1 〒-心冏+1

以V 对 作图，这时斜率为 ，纵截距为二，横截距为

④ Han as 作图法（略） 把（2）式等号两边乘以[S],得:

本实验主要以双倒数法，即 Li neweaver- Burk 作图法来测定碱性磷酸酶 Km 值。 具体原理如下： 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯 二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下（PH10.0,和60C ）,准确反应13分钟。在 碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长 620nm 比色。在一定条件下 色泽深浅与光密度成正比。反应式如下：

max

把（2）式等号两边乘以

，得:

，纵截距为

--------------

然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以光密度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lin eweaver- Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。

【仪器与试剂】

仪器：

1. 恒温水浴

2. 721型分光光度计

试剂：

1. 酚试剂：称钨酸钠（卡饨W .,・2[0）100g,钼酸钠（錚私Mo ., • 2 0）25g

置1500mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL,85%磷酸50mL和浓硫酸100mL 充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h （烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防

溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4 150g,蒸馏水50mL及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL，过滤即成，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。使用时用蒸馏水稀释一倍，最后酸度为

1N。

2. 2.5mM磷酸苯二钠基质液：称取625mg磷酸苯二钠（C6H5PO4Na22H2O）, 溶于

1,000ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，加数滴夜溴以防腐，置冰箱内可保存一年之久。

3. 碱性缓冲液（pH10.0）:称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g,溶解于蒸馏水中，并

稀释至1,000ml.

4. 碱性磷酸酶液：称取碱性磷酸酶1mg,加水3~4ml，冰箱内可保存五周左右。【实验步骤】

123456

2.5mM磷酸苯二

钠（ml）0.2

0.4

0.60.8 1.0 1.0

蒸馏水（ml）0.8:0.60.40.2-0.1碱性缓冲液

（ml）

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

混匀后，60r欲温5分钟

我试剂（磷钳钩酸）——蓝鱼化合物｝

以管为调零点，在波长处比色

【结果处理】

2以1/O.D为纵坐标，1/[s]为横坐标，按Lin eweaver- Burk作图，求出碱性磷酸酶的Km 值。

【注意事项】

1）加入碱性磷酸酶的量要准确

2）保温时间要准确

准确保温的方法：从第一管加入酶液开始计时，每隔1分钟向下一只试管加酶液，直至加完，至V准确13分钟立即向第一管加酚试剂，以终止其反应，并每隔1 分钟向下一只试管加酚试剂，直至加完止，这样保证每管准确保温13分钟。

【思考题】

1）Km的意义及其影响因子

2）为什么酶促反应速度以初速度表示

3）为什么O.D可直接代替V作图

4）分析自己的实验数据

实验（二）一一温度对酶活性的影响

【实验目的】

了解温度对酶活性及酶促反应速度的影响，加深对酶特性的认识。【实验原理】

每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低。一般而言，若酶处于过高的

温度环境中，会使酶活性永久丧失；而若处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或部分的恢复其活性。

【仪器与试剂】

仪器：

1 •冰箱 2.恒温水浴锅 3.试管和试管架

4 •吸量管及吸量管架 5.移液枪及枪头 6.胶头滴管

7 •烧杯

试剂：

1. PH6.8的缓冲液：量取15.45ml的0.2M磷酸氢二钠和4.55ml的柠檬酸混合摇匀即

可。

2.0.5%淀粉的0.5%氯化钠溶液：0.5g可溶性淀粉和0.5g氯化钠，溶于100ml 蒸馏水

（需加热）。

3. 0. 03175g/L 碘液

4. 1M HCl溶液

5.1M NaOH溶液

6.稀释100倍的唾

液7.冰水浴

【实验步骤】

1. 制管和预温

由于本实验对恒温反应要求较高，故每个温度梯度使用两支试管，分别标记为A管和B 管，同时欲温底物与酶。A管加入PH6.8的缓冲液和0.5%淀粉液；B 管使用移液枪加入稀释100倍的唾液，相对应的两支试管置于设定的温度下预温5mi n。

*6号管为对照组（比色时作为0号管），置于室温，且淀粉液用蒸馏水代替

2 .混合A、B管

将1号A管试剂迅速加入温度对应的B管中（为了最大限度保证酶的量），此时为计时的起点（使用秒表），摇匀后放回对应温度继续水浴。注意：转移A管试剂前需将其摇匀。

3 •时间控制

然后每隔1min或2min （时间自定）按上步操作依次把2、3、4、5、6号的A、B管混合，严格控制好时间。