生物素标记蛋白操作方法

生物素标记蛋白操作方法

下面的操作方法可以使约3－5分子的生物素与1分子的蛋白结合，对某些蛋白来说，生物素与蛋白的分子比可根据不同的生物素化要求进行调整。

1、溶解2－10mg蛋白于1ml的Buph Tm磷酸盐缓冲液中，并计算溶解的毫摩尔数。如果蛋白含有不恰

当的缓冲液（如Tris或者甘氨酸），可以通过在PBS中透析或浓缩的方法除去。计算：蛋白质量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白质的毫摩尔数。

2、在打开之前，平衡生物素至室温。加2mg Sulfo-NHS-Biotin于100ul超纯水中，加入足够量浓度的

生物素，一般对于10mg/ml蛋白来说超过12倍分子数，对于2mg/ml蛋白溶液应超过20倍，或者该试剂也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。（见下表）

3、室温30分钟，或冰上放置2小时。

4、用30ml PBS预洗纯化柱，上样，加入与欲收集量相同的缓冲液，收集0.5ml或1ml于单独的管中。

5、以280nm的吸收值测定蛋白含量。

6、生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入叠氮钠、甘油等保存。

HABA法检测生物素标记效果

试剂配制：①PBS（100mM磷酸盐，150mM Nacl PH7.2）

②HABA/亲和素溶液：10mg亲和素、600ul10mM HABA于19.4ml的PBS中，该溶液的A500大约在0.9-1.3之间，溶液于4℃保存可稳定2周。如果有沉淀形成（HABA溶液）可过滤后使用。

比色法检测生物素/蛋白质摩尔质量比：

1、吸取900ul HABA/亲和素溶液于1ml比色杯。

2、测定该溶液在500nm处的吸收值并记录为“A500HABA/Avidin”。

3、吸取100ul生物素标记的蛋白于杯中并测定500nm的吸光度值，记为A500HABA/Avidin/Biotin (数

值必须恒定15s以上)如果A500HABA/Avidin/Biotin的值不超过（≤）0.3，重新稀释待测样品并检测。

注：计算结果时必须考虑稀释度。

4、计算Biotin/Protein摩尔比

①A=生物素化的蛋白毫摩尔浓度＝蛋白浓度（mg/ml）/蛋白的分子量

②B=500nm处的吸光度变化

△A500=（0.9×A500HABA/Avidin）-A500HABA/Avidin/Biotin

③C=生物素的毫摩尔浓度=mmol Biotin/ml反应溶液=△A500/（34,000×光程）

④Biotin/Protein摩尔比=C·10·稀释倍数/A