农杆菌介导遗传转化原理
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（Importin-αis a component of one of the protein nuclear transport pathways found in eukaryotes）
VirE2： 非非特异DNA结合蛋白白，包裹T-DNA单链，使DNA 由随机卷曲状Baidu Nhomakorabea成为与电话听筒线相似的规则螺旋 ；这种形状使T-complex容易穿过核孔； VirE2将T-DNA包裹，可避免T-DNA从细菌向植物 转移过程中被降解；
解甲： 去除对转基因有不良影响的生生⻓长素、细胞分裂素 合成等基因； Ti质粒只有被解甲之后才能运用用到人人工工转基因实 验中。 农杆菌被解除武装，成了我们的俘虏，从而而为人人 类服务。
共整合载体
•Vir区及T-DNA区的反式作用用
!
双元载体的发明 存在于工工程菌株中的大大质粒（Vir区）； 方方便体外操作的小小质粒（含T-DNA区，大大约 十十几几个Kb）；
Binary vector system
A
农杆菌载体系统的 演化过程： 从野生生型质粒 到共整合载体 到双元载体系统
B
C
植物农杆菌转化的发展 •农杆菌的天然寄主：双子子叶植物； •植物的农杆菌转化由双子子叶植物开始 •已被转化的双子子叶植物：烟草、⻢马铃薯、番茄、茄子子、 大大豆豆、甜菜、拟南芥菜等； •单子子叶植物转化：20世纪90年代之后； •已被农杆菌成功转化的单子子叶植物：石石蒜科、百合科、 鸢尾科、薯蓣科和禾禾本科；
VirE2可在植物细胞膜上形成通道，使T-complex 进入入植物细胞； VirE2可与Importin-α以不依赖NLS的方方式结合， 促进T-complex向核的定向转运； VirE2的NLS与其DNA结合位点重叠，在Tcomplex向核的转运中可能不起作用用； VirE1： VirE2的分子子伴侣，可能帮助VirE2与T-DNA单链进 行行结合；
•毒性蛋白白基因的激活 VirA识别植物受伤后 分泌的酚类物质信 号，并自自我磷酸化， 进而而将磷酸化信号传 给VirG； VirG磷酸化后被活 化，作为转录因子子启 动或增加各毒性蛋白白 的表达；
http://www2.haut.edu.cn/d/d/gene/Chapt17/BIO7.asp
•T-complex形成 VirD2在D1的帮助下 识别T-DNA 25bp边 界 序 列 ， 利 用用 外 切 核酸酶的在第3、4 碱基之间形成缺刻; VirD2 的 Tyr29 与缺 刻的5’端共价结合； 随 着 D N A 的 合 成 生生 成 T- D N A 单 链 ， 与 VirD2和VirE2结合形 成T-complex；
•T-complex的转运 通过细菌细胞壁上由11个VirB蛋白白和VirD4组成的通 道从农杆菌向外输出
•T-complex在植物细胞内的运输及整合 VirD2： 含有NLS，并可与Importin-α以NLS依赖的方方式结 合，引导T-complex进入入细胞核，并帮助T-DNA插入入植 物染色色体中；
禾禾本科植物的转化 水水稻：Hiei等（1994） 水水稻能被成功转化是其成为禾禾本科模式植物的基 础。 玉玉米米：Ishida等，1996 大大⻨麦：Tingay等，1997 小小⻨麦：Cheng等，1997；Xia等，1999
禾禾本科植物转化的几几个经典实验
Hiei et al (1994) The Plant Journal 6(2): 271-282
http://bs.shinshu-u.ac.jp/botany/Crown_Gall.html
T-complex:
http://www.defra.gov.uk/environment/acre/uti/03.htm
VirC1突变后导致毒性丧失，其作用用可能是与TDNA右边界附近的overdrive序列结合； Overdrive序列促进T-DNA向植物的转移；
•根癌农杆菌含有Ti质粒 Ti：tumor-inducing •发根农杆菌含有Ri质粒 Ri：rhizogenic •天然农杆菌都含有Ti（或者Ri）质粒
天然Ti质粒的结构
200〜～800 Kb
T-DNA区（Transferred DNA）： 农杆菌Ti质粒中向植物中转移并整合进植物基因 组中的部分； 含有冠瘿碱合成基因、生生⻓长素合成基因、细胞分 裂素合成基因等； 真核启动子子； •T-DNA区大大小小：10〜～30 Kb •有的Ti质粒只含有一一个T-DNA区，有的则含有多个；
The Plant Journal (1994) 6(2): 271-282
Tingay et al (1997) The Plant Journal 11 (6): 1369-1376
Cheng et al (1997) Plant Physiol. 115: 971-980
从以上实验可总结转基因植株的鉴定方方法有： 抗生生素抗性标记； GUS染色色（组织化学染色色）； Southern杂交； PCR检测； RT-PCR检测； Northern杂交； 蛋白白电泳； 等等；
The Plant Cell, Vol. 18, 3350–3352
冠瘿病的害处： 苗木木感病后发育受阻；生生⻓长缓慢；植株矮小小；严重 时叶片片萎蔫、早衰，甚至至死亡； 大大树受害后树势衰弱，生生⻓长不良，提前落叶，果实 变小小，树龄缩短。主干受害降低材质及工工艺价值。
农杆菌能够导致植物产生生冠瘿病的原因： Ti（Ri）质粒
•农杆菌的附着 植物受伤后的分泌物中含有酚类物质（包括乙乙酰 丁香香酮，acetosyringone，AS）； 这些酚类物质可以被农杆菌感知，借助于趋化性 迁移至至植物受伤部位； 在 ChvA 、 ChvB （染色色体毒性基因）等的帮助 下，附着到受伤部位；
A. tumefaciens形态
农杆菌在ChvA、ChvB等 蛋白白帮助下附着在植物细 胞表面面
T-complex进入入植物细胞核的模型
http://bs.shinshu-u.ac.jp/botany/Crown_Gall.html
The Plant Cell (1996) 8: 1699-1710
补充几几点： •农杆菌向植物中转移的 DNA ⻓长度可达到 30 〜～ 150Kb ； •在T-DNA的左右两边界中，右边界相对更重要，其缺 失将导致转基因失败； •有时候，T-DNA左右边界之外的载体序列也有可能被 转到植物基因组中。 原因是： 1）T-DNA单链在形成过程中越过了左边界； 2）T-DNA的转移从左边界起始；
T-DNA区的左右边界序列高高度保守，为25bp 的正 向重复序列；
http://www2.haut.edu.cn/d/d/gene/Chapt17/BIO7.asp
毒性蛋白白区（ Vir区，Virulence）： 包括A、B、C、D、E、F、G等基因区，有的 基因区含有多个基因，形成Operons； Vir区约20Kb；
冠瘿碱： 农杆菌的碳源及氮源，其他物种不能代谢利用用， 使农杆菌拥有了独特的生生态位。
未侵染时栖息于土土壤表层，侵染植物导致冠瘿病 （根癌病） ； 侵染植物受伤部位（嫁接、修剪或其他外力力伤害 等）； 冠瘿瘤一一般位于主根与茎的结合部（树干基部， 即冠、Crown），但侧根、茎、枝上也有发病。
!
冠瘿碱代谢基因
农杆菌转化植物的过程 •植物受伤部位酚类化合物的分泌 •附着（chvA、chvB） •VirA/G的双组分系统感受受伤信号 （signal to A Pi to G） •其他Vir基因的表达 •T-DNA链的切出（VirD1+VirD2；Border to Border） •T-complex的形成 •运输（从细菌中输出、进入入植物细胞、入入核） •整合
A
B
C
PCR（A）、RT-PCR（B）和 Southern（C）鉴定结果
影响植物农杆菌转化效率的因素 •植物品种（基因型效应）； •农杆菌菌株及载体； •起始材料； •侵染所用用菌浓度（OD值）； •共培养条件(温度、时间、光照、培养基成分)； •共培养之后的筛选方方式； 等等；
农杆菌介导的 植物遗传转化
农杆菌的分类 革革兰氏氏阴性菌、杆状； 按侵染植物的后果分为： •根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 形成冠瘿（crown gall） •发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） 形成发根（hairy root）
按合成/代谢冠瘿碱（Opine）的种类，根癌农杆菌分为 ： •章⻥鱼碱（Octopine）型 •胭脂碱（Nopaline）型 •农杆碱（Agropine）型
农杆菌特异性的将T-DNA区转入入植物的基因组 中，其转移由 T-DNA 边界决定，与 T-DNA 区内的 DNA序列无无关。 利用用这种特性，我们就可以将外源基因插入入到 T-DNA区中，达到转基因的⺫目目的。
农杆菌介导的植物转化 ——对自自然从发现到认识到利用用
农杆菌载体系统的演化 解甲（disarmed） 共整合载体（co-integrated plasmid） 双元载体系统（binary vector system）
VirE2： 非非特异DNA结合蛋白白，包裹T-DNA单链，使DNA 由随机卷曲状Baidu Nhomakorabea成为与电话听筒线相似的规则螺旋 ；这种形状使T-complex容易穿过核孔； VirE2将T-DNA包裹，可避免T-DNA从细菌向植物 转移过程中被降解；
解甲： 去除对转基因有不良影响的生生⻓长素、细胞分裂素 合成等基因； Ti质粒只有被解甲之后才能运用用到人人工工转基因实 验中。 农杆菌被解除武装，成了我们的俘虏，从而而为人人 类服务。
共整合载体
•Vir区及T-DNA区的反式作用用
!
双元载体的发明 存在于工工程菌株中的大大质粒（Vir区）； 方方便体外操作的小小质粒（含T-DNA区，大大约 十十几几个Kb）；
Binary vector system
A
农杆菌载体系统的 演化过程： 从野生生型质粒 到共整合载体 到双元载体系统
B
C
植物农杆菌转化的发展 •农杆菌的天然寄主：双子子叶植物； •植物的农杆菌转化由双子子叶植物开始 •已被转化的双子子叶植物：烟草、⻢马铃薯、番茄、茄子子、 大大豆豆、甜菜、拟南芥菜等； •单子子叶植物转化：20世纪90年代之后； •已被农杆菌成功转化的单子子叶植物：石石蒜科、百合科、 鸢尾科、薯蓣科和禾禾本科；
VirE2可在植物细胞膜上形成通道，使T-complex 进入入植物细胞； VirE2可与Importin-α以不依赖NLS的方方式结合， 促进T-complex向核的定向转运； VirE2的NLS与其DNA结合位点重叠，在Tcomplex向核的转运中可能不起作用用； VirE1： VirE2的分子子伴侣，可能帮助VirE2与T-DNA单链进 行行结合；
•毒性蛋白白基因的激活 VirA识别植物受伤后 分泌的酚类物质信 号，并自自我磷酸化， 进而而将磷酸化信号传 给VirG； VirG磷酸化后被活 化，作为转录因子子启 动或增加各毒性蛋白白 的表达；
http://www2.haut.edu.cn/d/d/gene/Chapt17/BIO7.asp
•T-complex形成 VirD2在D1的帮助下 识别T-DNA 25bp边 界 序 列 ， 利 用用 外 切 核酸酶的在第3、4 碱基之间形成缺刻; VirD2 的 Tyr29 与缺 刻的5’端共价结合； 随 着 D N A 的 合 成 生生 成 T- D N A 单 链 ， 与 VirD2和VirE2结合形 成T-complex；
•T-complex的转运 通过细菌细胞壁上由11个VirB蛋白白和VirD4组成的通 道从农杆菌向外输出
•T-complex在植物细胞内的运输及整合 VirD2： 含有NLS，并可与Importin-α以NLS依赖的方方式结 合，引导T-complex进入入细胞核，并帮助T-DNA插入入植 物染色色体中；
禾禾本科植物的转化 水水稻：Hiei等（1994） 水水稻能被成功转化是其成为禾禾本科模式植物的基 础。 玉玉米米：Ishida等，1996 大大⻨麦：Tingay等，1997 小小⻨麦：Cheng等，1997；Xia等，1999
禾禾本科植物转化的几几个经典实验
Hiei et al (1994) The Plant Journal 6(2): 271-282
http://bs.shinshu-u.ac.jp/botany/Crown_Gall.html
T-complex:
http://www.defra.gov.uk/environment/acre/uti/03.htm
VirC1突变后导致毒性丧失，其作用用可能是与TDNA右边界附近的overdrive序列结合； Overdrive序列促进T-DNA向植物的转移；
•根癌农杆菌含有Ti质粒 Ti：tumor-inducing •发根农杆菌含有Ri质粒 Ri：rhizogenic •天然农杆菌都含有Ti（或者Ri）质粒
天然Ti质粒的结构
200〜～800 Kb
T-DNA区（Transferred DNA）： 农杆菌Ti质粒中向植物中转移并整合进植物基因 组中的部分； 含有冠瘿碱合成基因、生生⻓长素合成基因、细胞分 裂素合成基因等； 真核启动子子； •T-DNA区大大小小：10〜～30 Kb •有的Ti质粒只含有一一个T-DNA区，有的则含有多个；
The Plant Journal (1994) 6(2): 271-282
Tingay et al (1997) The Plant Journal 11 (6): 1369-1376
Cheng et al (1997) Plant Physiol. 115: 971-980
从以上实验可总结转基因植株的鉴定方方法有： 抗生生素抗性标记； GUS染色色（组织化学染色色）； Southern杂交； PCR检测； RT-PCR检测； Northern杂交； 蛋白白电泳； 等等；
The Plant Cell, Vol. 18, 3350–3352
冠瘿病的害处： 苗木木感病后发育受阻；生生⻓长缓慢；植株矮小小；严重 时叶片片萎蔫、早衰，甚至至死亡； 大大树受害后树势衰弱，生生⻓长不良，提前落叶，果实 变小小，树龄缩短。主干受害降低材质及工工艺价值。
农杆菌能够导致植物产生生冠瘿病的原因： Ti（Ri）质粒
•农杆菌的附着 植物受伤后的分泌物中含有酚类物质（包括乙乙酰 丁香香酮，acetosyringone，AS）； 这些酚类物质可以被农杆菌感知，借助于趋化性 迁移至至植物受伤部位； 在 ChvA 、 ChvB （染色色体毒性基因）等的帮助 下，附着到受伤部位；
A. tumefaciens形态
农杆菌在ChvA、ChvB等 蛋白白帮助下附着在植物细 胞表面面
T-complex进入入植物细胞核的模型
http://bs.shinshu-u.ac.jp/botany/Crown_Gall.html
The Plant Cell (1996) 8: 1699-1710
补充几几点： •农杆菌向植物中转移的 DNA ⻓长度可达到 30 〜～ 150Kb ； •在T-DNA的左右两边界中，右边界相对更重要，其缺 失将导致转基因失败； •有时候，T-DNA左右边界之外的载体序列也有可能被 转到植物基因组中。 原因是： 1）T-DNA单链在形成过程中越过了左边界； 2）T-DNA的转移从左边界起始；
T-DNA区的左右边界序列高高度保守，为25bp 的正 向重复序列；
http://www2.haut.edu.cn/d/d/gene/Chapt17/BIO7.asp
毒性蛋白白区（ Vir区，Virulence）： 包括A、B、C、D、E、F、G等基因区，有的 基因区含有多个基因，形成Operons； Vir区约20Kb；
冠瘿碱： 农杆菌的碳源及氮源，其他物种不能代谢利用用， 使农杆菌拥有了独特的生生态位。
未侵染时栖息于土土壤表层，侵染植物导致冠瘿病 （根癌病） ； 侵染植物受伤部位（嫁接、修剪或其他外力力伤害 等）； 冠瘿瘤一一般位于主根与茎的结合部（树干基部， 即冠、Crown），但侧根、茎、枝上也有发病。
!
冠瘿碱代谢基因
农杆菌转化植物的过程 •植物受伤部位酚类化合物的分泌 •附着（chvA、chvB） •VirA/G的双组分系统感受受伤信号 （signal to A Pi to G） •其他Vir基因的表达 •T-DNA链的切出（VirD1+VirD2；Border to Border） •T-complex的形成 •运输（从细菌中输出、进入入植物细胞、入入核） •整合
A
B
C
PCR（A）、RT-PCR（B）和 Southern（C）鉴定结果
影响植物农杆菌转化效率的因素 •植物品种（基因型效应）； •农杆菌菌株及载体； •起始材料； •侵染所用用菌浓度（OD值）； •共培养条件(温度、时间、光照、培养基成分)； •共培养之后的筛选方方式； 等等；
农杆菌介导的 植物遗传转化
农杆菌的分类 革革兰氏氏阴性菌、杆状； 按侵染植物的后果分为： •根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens） 形成冠瘿（crown gall） •发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） 形成发根（hairy root）
按合成/代谢冠瘿碱（Opine）的种类，根癌农杆菌分为 ： •章⻥鱼碱（Octopine）型 •胭脂碱（Nopaline）型 •农杆碱（Agropine）型
农杆菌特异性的将T-DNA区转入入植物的基因组 中，其转移由 T-DNA 边界决定，与 T-DNA 区内的 DNA序列无无关。 利用用这种特性，我们就可以将外源基因插入入到 T-DNA区中，达到转基因的⺫目目的。
农杆菌介导的植物转化 ——对自自然从发现到认识到利用用
农杆菌载体系统的演化 解甲（disarmed） 共整合载体（co-integrated plasmid） 双元载体系统（binary vector system）