丝氨酸蛋白酶水解机制(教学课件)

14、 抱 最 大 的 希望 ，作最 大的努 力。2020年 10月 18日 星期日 下午2时 21分58秒 14:21:5820.10.18
15、 一 个 人 炫 耀什 么，说 明他内 心缺少 什么。 。2020年 10月 下午2时 21分20.10.1814:21October 18, 2020
(3)丝氨酸蛋白水解酶的空间结构：
X射线衍射法：通常，都是将表达蛋白的基因PCR之后克隆到一种
表达载体中，然后在大肠杆菌中诱导表达，提纯之后摸索结晶条件。 结晶后，将晶体进行x射线衍射，收集衍射图谱，通过一系列的计算， 很快就能得到蛋白质的原子结构。
牛的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及住的弹性蛋白酶在结构上很相似， 这三种酶大约由240个氨基酸残基组成，三者的一级结构大约有 40% 是相同的，且活性中心的必需氨基酸也大致相同（Ser、His、Asp）
4.4.5 丝氨酸蛋白酶水解机制
什么是丝氨酸蛋白酶？
丝氨酸蛋白酶是一个蛋白 酶家族，其激活是通过活 性中心一组氨基酸残基变 化实现的，它们之中一定 有一个是丝氨酸（Ser， serine）。在哺乳类动物 里面，丝氨酸蛋白酶扮演 着很重要的角色，特别是 在消化，凝血和补体系统 方面。
Fra Baidu bibliotek
最典型的三种丝氨酸蛋白酶：
乙酰胆碱是一种生物体内常见的神经传导物质，自身具有 很高的毒性，而负责水解完成传递信息任务后的乙酰胆碱 的乙酰胆碱酯酶（乙酰胆碱酯酶可将乙酰胆碱分解成无毒 性的乙酸和胆碱）失活之后就会导致乙酰胆碱在生物体内 不断地积累，最终导致生物中毒死亡。
(2)活性His（组氨酸）基团：
N-对甲苯磺酰苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）其中氯甲基酮基是 一个很强的烷基化剂，它能够与反应中心His-57的咪唑基发 生烷基化反应，并最终引起酶的失活。
Step 1：Ser-195作用于底物的肽键酰基，发起亲核进 攻，形成一个包括Ser-195的羟基、底物酰基和氨基在内 的共价四联体中间物。
Step 2：四面体中间物分解，即生成酰基-酶中间物并伴随着C-N 键的断裂。
R1NH2
H2O
肽键断裂之后，R‘-NH2基团作为离去基团从反应体系中 离去，此时水分子进入，其氧原子攻击羰基上的碳原子，从而 又形成了一个水分子参与的四联体中间物。
胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 弹性蛋白酶
同属消化酶系，在胰腺 泡内合成并分泌到十二 指肠中。均可催化肽键 的水解反应，但对肽键 的选择性则有所不同
1.水解作用的动力学模型
胰凝乳蛋白酶不仅可以水解肽键，同时也可以水解一般 的酯键。以对硝基苯酚乙酸酯为例：
胰凝乳蛋白酶
对硝基苯酚乙酸酯
乙酸 对硝基苯酚
这一反应过程具有两相特征：
11、 人 总 是 珍 惜为 得到。 20.10.1814:21:5814:21Oct-2018-Oct-20
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13、 生 气 是 拿 别人 做错的 事来惩 罚自己 。20.10.1820.10.1814:21:5814:21:58October 18, 2020
2.酶活化中心必需基团的测定
(1)活性Ser基团：
二异丙基磷酰氯（DIPF）能特异性与 Ser基团的-OH反应，其结果导致作 为酶活性中心的Ser的残基发生不可 逆失活，此方法可有效确定胰凝乳蛋 白酶中的Ser-195是酶活性中心必需 氨基酸残基。
DIPF作用于动物上时，即可显示出很高的神经毒性，动 物体内的乙酰胆碱酯酶（丝氨酸蛋白水解酶的一种）能够 与DIPF反应，使其自身失活，失去对乙酰胆碱的水解作 用。
快速反应相：对硝基苯酚离子快速形成，与酶的浓度 成正比。 恒态反应相：对硝基苯酚离子形成较缓慢，形成速率 恒定。（决定反应速率的关键步骤）
快速反应相过程中酶和底物结合释放出对硝基苯酚离 子，同时形成乙酰基-酶中间体；而恒态反应相过程则 是乙酰基-酶中间体缓慢水解，放出酶，使之与底物相 结合继续释放出对硝基苯酚离子。由于乙酰基-酶的水 解很慢，使体系中酶浓度下降，进而导致对硝基苯酚 释放速率变慢。
16、 业 余 生 活 要有 意义， 不要越 轨。2020年 10月 18日 星期日 2时21分 58秒14:21:5818 October 2020
17、 一 个 人 即 使已 登上顶 峰，也 仍要自 强不息 。下午 2时21分 58秒下 午2时 21分14:21:5820.10.18
谢谢大家
3.催化作用机制
（1）结构特性
以胰凝乳蛋白酶举例，其活性中心有三个必需氨基酸残基： Ser-195，His-57和Asp-102，这三部分通过氢键结合，整体呈 三角形，即所谓的“催化三元区”。“催化三元区”的最显著特 征是Ser-195的羟基高度极化，具有很高的亲核进攻能力。
（2）亲核共价催化作用——易形成四联体结构的中间物
Step 3：酰基-酶中间物的解离，这时His-57作为广义酸起催化作用。
9、 人 的 价 值 ，在 招收诱 惑的一 瞬间被 决定。 20.10.1820.10.18Sunday, October 18, 2020
10、 低 头 要 有 勇气 ，抬头 要有低 气。14:21:5814:21:5814:2110/18/2020 2:21:58 PM