端粒酶基本原理及技术方法

端粒酶基本原理及技术方法
摘要:近几年研究表明端粒酶与肿瘤的
发生发展密切相关，推测可能是一个广泛的肿瘤标志物。

本文就端粒酶活性检测的原理，端粒酶的提取方法，TRAP扩增技术，四种结果分析方法以及如何进行质量控制与半定
量测定进行综述。

端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。

人端粒酶RNA组分于1995年
被克隆，其中含有端粒重复序列的模板；蛋白质组分具有RNA依赖的DNA多聚酶活性，结构尚不清楚。

端粒酶能以自身RNA的模板区为模板复制合成端粒序列。

在胚性细胞等增殖活跃的细胞中具有端粒酶活性，而在正常成熟体细胞中端粒酶失活，同时还发现绝大多数肿瘤细胞都呈端粒酶阳性，而在癌旁组织和正常组织阳性率很低，推测端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标志物[1]。

因此近几
年端粒酶在各种肿瘤中的研究日益深入，同时促进了检测方法的改进与完善。

本文对其
检测方法综述如下。

1基本原理
端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加
6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺凝胶电
泳可显示6个碱基差异的梯带。

1994年Kim 建立了基于PCR基础上的端粒重复序列扩增法。

TRAP反应原理见下图。

首先合成一个18nt的TS做上游引物，端粒酶结合TS末端的GTT并合成agggttag，然后每经过一次转位合成一个ggttag的6
碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入一个
24nt的CX做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。

2基本技术方法
标本来源手术摘除组织，针吸活检组织，胸水，腹水，膀胱或胰管冲洗液，棉拭子所取分泌物和尿液等。

端粒酶的提取方法早期采用超声等物
理破碎的方法在不同细胞中的提取效率差
异较大，此后采用去污剂裂解的方法在少量细胞获取了较稳定的端粒酶提取液。

现详述
如下：40～100mg冷冻组织或104～106沉淀细胞用冰预冷的洗液
[10mMhepes-KOH,,10mMKCI,1MmDTT]洗1次，10000g4℃离心1min，沉淀加200μl冷裂解液
[10mMtris-HCI,1mMMgC12,1mMEGTA,,5mMβ
-巯基乙醇，％CHAPS，10％甘油]，自动匀浆器冰浴中匀浆，450rpm,25min,16000g4℃离心20min，移取上清160μl，部分样品用于蛋白定量，其余迅速冷冻，-70℃保存。

端粒酶经小于10次冻融可保持活性稳定。

部分学者对某些标本用％Tween-20代替％CHAPS获得更好的效果[2]。

扩增50μlTRAP体系包含
20mMtris-HCI，，63mM,KCI,％Tween-20，
1mMEGTA,50μMdNTP，μgtS，1μgT4基因32蛋白，/ml牛血清白蛋白，1～2μlCHAPS 细胞提取液蛋白，～μl[α-32P]dGIP或[α-32P]dGIP，这一反应体系可同时满足端粒酶Tap聚合酶的活性需要，23℃10min合成端粒酶延伸产物后，94℃3s灭活端粒酶，加入μgcX和2UTaq酶，94℃30s，50℃30s，
72℃扩增27个循环，25μl产物进行15％PAGE凝胶电泳。

引物设计为了防止上、下游引物之间的结合，在CX引物上设计了3个不匹配碱基，单链结合蛋白T4基因32蛋白可进一步避免引物之间的结合，TS和CX引物被广为采用，在上述条件下，只有延伸了三至更多的GGTTAG片断才有特异扩增，即得到从40bp
开始的6bp差异的梯带。

Broccoli等以
5′-GGCGCG3-3′代替CX引物，由于增加了
G-C含量，可提高退火温度，进一步避免引
物间的结合，增加特异性[3]。

Oncor公司设计RP引物代替CX引物，得到从50bp开始
的6bp差异的梯带[4]。

3扩增片断的检测
同位素法Kim建立的方法即为同位素法，其应用最多。

采用[α-32P]dGTP或dCTP掺入的报道很多，但部分学者用[γ-32P]dATP 和T4激酶标记TS引物的5′端，发现更易
于检出低水平的端粒酶，同时更易定量
[3,5]。

PAGE凝胶电泳后在X-光片上放射自显影或用Phosphoimager仪扫描测定3h。

同
位素法的优点是灵敏度高，100个永生化细胞27个循环即可检出，缺点是存在放射性污染，且放射自显影需8h至两天以上时间，时间较长。

染色法电泳后用SYBRgreen或EB染色，然后紫外灯下观察或用CCD图像系统测定[4,6,7]。

EB在302nm紫外透射仪和桔红色紫外滤光片下效果最好，可得与SYBRgreen 相近的敏感性。

染色法简便，快速，灵敏度为100个永生化细胞30个循环，由于染色带的信号强度不能精确反映其分子数，因此染色法只能判定相对端粒酶活性，而不能测定端粒酶延伸产物的确切数量。

荧光法加入10pmol荧光素标记的TS和/或CX引物扩增，经8％的变性PAGE凝胶电泳，DNA测序仪自动读取数值，片断管理系统软件自动计算扫描曲线的峰高和峰面积，从上样到出结果仅需90min。

荧光系统极敏感，为避免过量扩增产物可能给出不可靠结果，要使用～μg的低蛋白量，扩增27个循环，由于片断管理系统能自动检出很微弱的荧光，因此不能精确测定低水平端粒酶活性。