生物化学检验常用技术

厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。
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3、Lambert-Beer定律的应用条件
Lambert-Beer定律适用于: 可见光、紫外光、红外光和均匀非散射 的液体以及分散均匀的固态或气态样品.
Baidu Nhomakorabea
单色光 均匀介质 吸收物质无相 互作用
4、Lambert-Beer定律的偏离现象
溶液：稀溶液、化学变化 光学; 非单色光、散射和折射 仪器; 光源、实验条件
③灵敏 ④设备简单
⑤应用范围窄
影响火焰光度分析的因素
1、激发条件
火焰温度要适当，温度过低灵敏度下降，温度 太高则碱金属电离严重，影响测量的线性关系。
2、试样的种类和组成 3、试液中共存离子对测定有影响 4、仪器的质量
（二）、荧光分光光度法
荧光的定义：
某些物质受紫外光或可见光照射 激发后能发射出比激发光波长较 长的光。
酶电极
将生物酶涂布在离子选择性电极或其它传感器的敏感膜上，通过酶催化作 用，使待测物质产生能在该电极上响应的离子或化合物，间接测定该物质。
脲酶催化分解尿素产生NH3、CO2， 溶于水可得到不同产物NH3、CO2、 NH4+、HCO3-等，可用相应的离子选 择性电极来检测它们，间接得到尿 素的含量。 酶的催化反应专一强；酶电极有极高的选择性。作为一种生物传感器，酶电极特别适用于 生物医学、生物化学等领域。 ①选择适合的指示电极
酶电极的制作过程
②制成具有催化活性的水不溶性酶膜 ③把酶膜固定在电极的表面(酶的固定化)
常用的固定化技术有：吸附、试剂交联、 共价键合、 包埋法(酶与载体聚丙酰胺混合 后直接包在电极敏感部分形成酶凝胶层)。
几种酶电极的品种与性能
测定物质 葡萄糖 尿素(脲) 胆固醇 L－谷氨酸 L－赖氨酸
酶 葡萄糖氧化酶 脲酶 胆固醇氧化酶 谷氨酸脱氢酶 赖氨酸脱羧酶
可用电极测定的气体
CO2 + H2O === HCO3- + H+ NH3 + H2O === NH4+ + OHSO2 + H2O === HSO3- + H+ 2NO2 + H2O === NO3- + NO2- + H+ H2S + H2O === HS- + H3O+ HCN + H2O === H3O+ + CNHF + H2O === H3O+ + F凡是溶于水释放H+的反应，都可以用pH玻璃电极检出； 而后三种分别可以用 S2- 、 CN- 、 F- 等离子选择性电极来检测。
电导分析法 在外电场作用下，以电解质溶液中正负离子迁移为基础的电化学分析法。
④ 缺点
需要有专用的离子选择性电极。
常用的离子选择电极
根据国际纯粹及应用化学联合会(IUPAC)的建议，离子选 择性电极一般采用如下分类：
玻璃膜电极
气敏电极
气敏电极是一种气体传感器，测定溶液中的气体含量。 原理：利用待测气体对某一化学平衡的影响，使平衡中某特定 离子的活度发生变化，来测定试液中被测气体的分压(含量)。 如，二氧化碳气敏电极：微孔气体渗透膜憎水但能透气 (由醋酸纤维、聚 四氟乙烯、聚偏氟乙烯等材料制成)。测定时，CO2气体通过微孔渗透膜与 中介溶液接触 (中介液是0.001mol/L的NaHCO3)；由于CO2与H2O结合生成碳 酸，从而影响到碳酸氢钠的电离平衡。 用pH玻璃电极间接测定CO2的含量 在气敏电极的中介溶液中放入玻 璃电极。测量时，控制试液的酸 碱度，使CO2通过气透膜扩散加 入气敏电极；引起中介溶液pH的 改变。测定中介溶液的pH值，即 可计算出试液中CO2的浓度。 气敏电极通过界面发生化学反 应进行工作的，离子电极用来 指示中介液中某一离子活度的 变化。溶解在水溶液中的气体， 只要能生成可用离子选择性电 极检出的离子，均可用气敏电 极测定。
发射光谱是指样品本身产生的光谱被检 测器接收；吸收光谱是光源发射的光谱 被样品吸收了一部分，剩下的那部分光 谱被检测器接收。
火焰光度法
荧光光度法
（一）、火焰光度法
火焰光度法是以火焰为激发光源，用光电检测系统测量被测 元素所发射的辐射强度来进行定量分析的方法。 它是一种简化的发射光谱分析法
FP640火焰光度计
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5.标准溶液设置的浓度范围足够大。
2．比较法
己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测 定标准管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品浓度，可直接 计算出标本的浓度，计算公式为：
CR=(AR ×Cs)/As
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二、发射光谱分析法
处于激发态的待测元素，原子回到基态 时以辐射的形式释放出能量，由此而产生的 光谱称为发射光谱，对元素进行定性与定量 分析的方法。
5、空白溶液的选择
在分光光度法中，为消除显色剂及样品中各种共存有色物质产生的干扰、 抵消比色皿和试剂对入射光的影响而用来调节仪器百分透光率为100%的溶液。
蒸 馏 水
试 剂
样 品
不 含 待 测 元 素
不 显 色
1、溶剂空白：不加样品和任何试剂，用纯溶剂（如蒸馏水或其他有机溶剂）作参比溶液。 选择原则：当显色剂及其它试剂均无色，被测试样中又无其他有色离子时，选用溶剂参比。 2、试剂空白：用不加样品，而显色剂和其他试剂都相同的溶液作参比溶液。 选择原则：当显色剂本身有颜色或其它试剂有颜色，被测试样中又无其他有色离子时，选用试剂参比。 3、样品空白：用不加显色剂的样品溶液作参比溶液。 选择原则：当试样溶液有颜色，而试剂、显色剂均无颜色时，选用样品空白。
第二节 电化学分析技术
一、电位分析法― ISE
电位分析法 利用电极电位与浓度的关系测定物质含量的电化学分析方法。
离子选择电极 ISE
一类用特殊敏感膜制成，对溶液中某种特定离子有选择性响应的电化学传感器
电解质溶液中参与电化学反应的离子的有效浓度
ISE基本结构
内参比电极 电极壳体 内参比溶液
敏感膜
在电位分析中，构成电池的 两个电极，其中一个，其电 位值随待测离子浓(活)度的 变化而变化，能指示待测离 子的浓(活)度，称为指示电 极，或离子选择性电极。
离子选择性电极：电位法测定溶液中某种定离子活度的指示电极； 能在多种离子存在的混合液中，选择性地响应该特定离子，指示 出这种离子活度变化情况，测定离子的活度或浓度。
第三章
生物化学检验常用技术
电 基电干 化光 因泳化 学谱 扩分学 分分 增析分 析析 技技析 技技 术术技 术术
第一节 光谱分析技术
吸收光谱分析技术 发射光谱分析技术 散射光谱分析技术
一、吸收光谱分析法
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光源
钨灯、卤钨灯 350～1000 氢灯、氘灯 180～360
单色器
滤光片 棱镜 光栅
当化合物含量太少,一般分析方法灵敏度不够时,使用荧光分析技术就能解决测定问题。
三、散射光谱分析法
光的散射
用单色光照射透明溶液时，大部分按原来 方向透射，而一小部分则按不同的角度散 射开来。
散射光谱分析法 利用悬浮颗粒混浊液的散射光强度或对入射光减弱的原理进行定量分析的方法。
透射比浊与散射比浊是免疫比浊的常见的两种方法，其反应的原理一样，只是检测的 光信号与仪器的检测器有区别。 1、透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所 有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检 测的周期较长。 2、散射比浊的优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪 器，试剂价格高。
离子选择性电极的类型和品种很多， 外形也差异很大；但基本结构都包括： 对特定离子有选择性响应的薄膜(敏感 膜或传感膜)、内参比溶液与内参比电 极。 敏感膜将内侧参比溶液与外侧的待 测离子溶液分开，是电极的关键部位。
离子选择性电极 结构示意图
电极电位
电极电位测量
参比电极
指示电极
而另一个电极，其电 位不受试液组成变化的 影响，具有较恒定的数 值，只是作为测量电位 的标准，称为参比电极 (参考电极)。
4、平行操作空白：按样品分析完全相同的操作步骤，用不含待测元素的样品进行平行操作， 以消除操作过程中引入干扰杂质所带来的误差。 选择原则：当操作过程中由于试剂、器皿、水和气等因素引入了一定量的被测试样组分的干扰离子 5、不显色空白：可将一份试样加入适当的掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂 和其它试剂均按照操作手续加入，以此作为参比溶液，这样可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。 选择原则：当显色剂和被测试样均有颜色时，可选用此法。
(二)、分光光度法在生化检验中的应用
灵敏度高、操作简便、应用广泛
1、对未知化合物进行定性分析
定性依据： 最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε
2、对待测物质进行定量测定
标准曲线法和比较法
(1).标准曲线法
方法：
根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内 与吸光度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液 （浓度应包含高、中、低浓度范围），按标本处理方法 作相同处理，在特定波长下测定吸光度，以标准液浓度 为横座标，以吸光度为纵座标，将对应各点连成一条通 过原点的直线，这条直线称为标准曲线。待测溶液测定 吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的浓度。
荧光分光光度法 利用物质吸收较短波长的光能后发 射较长波长特征光谱的性质，对物 质定性或定量分析的方法。
荧光产生的原理：
化学物质能从外界吸收并储存能量 （如光能、化学能等）而进入激发态， 当其从激发态再回复到基态时，过剩 的能量可以电磁辐射的形式放射（即 发光）。
分析测定蛋白质、核酸、维生素等; 对某些激素及其代谢产物的测定;
火焰光度法分析示意图
火焰光度法的特点
①快速 ②准确 试样溶液于数分钟内可完成测定
火焰光源稳定性高，干扰少，误差为2％~5 ％，可用于微量分析和常量分析
分析碱金属与碱土金属，绝对灵敏度可达 0．1～10×10－6 g 被测试样易被火焰激发，产生的谱线较简单，且 均在可见光区，故使谱线分离和测量的设备简单 主要用于碱金属和部分碱土金属的测定
吸收池
玻璃比色皿 石英比色皿
检测器
显示器
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(一)、分光光度技术的基本原理
1、吸光度与透光度
当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一 部分光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为
I，I和I0之比称为透光度，即：
入射光 I0
透射光 I
T = I/I0
T×100%为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度 即：
电位分析法的特点：
① 选择性好 在多数情况下，共存的离子干扰小，对组成复杂的试样往往 不需要分离处理就可直接测定。 ② 灵敏度高 电位法的检出限为10-5～10-8 定，电位滴定法适于常量分析。
mol/L，适于微量组分的测
③ 快速 仪器设备简单、操作方便、分析快速、测定范围宽、不破坏试液， 易于实现分析自动化。
②标准比较法 ③标准加入法
将已知的小体积标准溶液，加入已知较大体积的待测液中，根据加入前后电 位值变化，求得待测液中被测离子得浓度。
2、间接法： 样品经缓冲溶液稀释后由电极测量离子活度。
二、电导分析法
利用电解质溶液的电导值来确定物质含量的分析方法 什麽是电导？ ●衡量电解液导电能力的量度值 ●这里所说的电导是指电解质溶液中正、负 离子在外电场作用下的迁移而产生的电流传导 ●导电能力与溶液中正负离子的数目、离子 所带的电荷量、离子在溶液中迁移的速率等因 素有关
检测物 O2 NH3 H2O2 NH4+ CO2
测定范围(mol/L) 10-4～2*10-2 10-5～10-2 10-5～10-2 10-4～10-1 10-4～10-1
离子选择性电极的分析方法
1、直接法： 样品不经稀释，直接由电极测量离子活度。
①标准曲线法
用测定离子的纯物质配制一系列已知活度或浓度的标准溶液，用离子计测定， 绘制电极电位与活度对数的关系曲线；然后在相同条件下测定样品，由标准 曲线查得浓度。
A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I
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2、Lambert-Beer定律
当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时，吸光度与溶液层 厚度和溶液浓度成正比。
A = KLC
A K L C 为吸光度； 为比例常数，称为吸光系数； 为溶液层厚度，称为光径； 为溶液浓度
L
Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体 Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层