产胶原蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选
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通过 对 初 步 筛 选 出 的 菌 种 进 行 甲 基 红 (MR) 、革兰氏染色 、明胶液化实验等菌种的生理 生化实验 ,来确定能够产胶原蛋白酶的菌种 。 1. 3 胶原蛋白酶的提取及酶活的测定 1. 3. 1 提 取
将通过生理生化实验筛选出的菌种 ,在明胶 液体培养基上 ,32 ℃条件下培养 48 h 。然后将培 养液 4 000 r/ min 离心 10 min ,取上清液 。冰浴 条件下 ,在上清液中缓慢加入硫酸铵至终质量分 数为 70 %。4 ℃静置过夜后 , 8 000 r/ min 离心 15 min ,收集沉淀 ,沉淀溶解到 p H 7. 5 缓冲溶液 中 ,透析 24 h 后冰箱保存备用 。 1. 3. 2 酶活测定
Tab. 1 Phenomenon of st rains’p hysiology2biochemist ry
菌种 透明圈比值
①号
1. 7
形态 短杆
生理生化特性 菌落特征 白色 ,圆形 ,表面光滑 ,边缘整齐 ,有菌丝出现
革兰氏染色 好氧性 MR 实验 明胶液化实验
阳性
好氧 阴性
阴性
②号
2. 8
短杆 两端钝圆 ,凸起 , 放射状 , 边缘叶状 ; 表面皱褶 , 无光 泽 ,灰白色 ,带有鳞片 ,不透明 ,无菌丝出现 ,味道较大
( 大连工业大学 生物与食品工程学院 , 辽宁 大连 116034 )
摘要 : 为了得到产胶原蛋白酶的微生物 ,以海产品市场附近采集的污泥为样品 ,经过富集培养后通过
明胶培养基进行筛选 ,获得 1 株产胶原蛋白酶的菌株 。通过形态观察和生理生化特征分析 ,以透明圈和
菌落直径之比 ( HC) 为检测指标 ,初步鉴定该菌株为芽孢杆菌属 。对它产生的胶原蛋白酶进行分离和活
另取 3 支试管 ,分别加入 1 mL 样品滤液 、对 照滤液和水 ,然后各加入 5 mL 0. 55 mol/ L 碳酸 钠溶液和 1 mL Folin2酚试剂 ,摇匀后在 30 ℃下 显色 15 min ,在 680 nm 处测吸光值 。以酪氨酸 为标准制作标准曲线 。
酶活力 ( U) = ( A样 - A对 ) ×K ×N ×V / t 式中 , A样 为样品液吸光度值 ; A对 为对照液吸光 度值 ; K 为吸光度值 1 对应的酪氨酸微克数 ; t 为 酶促反应时间 ; N 为酶液稀释倍数 (本实验 N 为 1) ;V 为酶促反应总体积 。
取 1 支试管 ,加入 2. 0 mL 0. 5 %的酪蛋白溶 液 ,于 30 ℃水浴中预热 5 min ,再加入 1. 0 mL 已 预热好的枯草杆菌蛋白酶液 ,水浴中准确保温
10 min后 ,立即加入 3. 0 mL 的 10 %三氯醋酸溶 液 ,摇匀静置 15 min ,过滤 ,收集的即是样品的滤 液 。另取一试管 ,先加入 1. 0 mL 酶液和3. 0 mL 的 10 %三氯醋酸溶液 ,再加入 2. 0 mL 0. 5 %的酪 蛋白溶液 ,混匀后于 30 ℃水浴保温10 min ,过滤 , 收集滤液作为对照溶液 。
44. 982 U/ mL 由于是粗酶液 ,含有其他酶类且稀释度较大 ,
所以酶活力较小 。 2. 3 胶原蛋白酶转化及其产物
将胶原蛋白溶液与酶液按比例混合 ,在一定 条件下反应 。采用 SDS2PA GE 凝胶电泳测定胶 原蛋白酶解情况及产物分子质量范围 。
3 结 论
实验结果表明 ,以海产品市场附近采集的污 泥为样品 ,经过富集培养基培养 48 h 后在 10 - 5 的 稀释度下利用明胶培养基筛选出能够产胶原蛋白 酶的菌种 ,并且菌种传代稳定性非常高 。通过生 理生化实验和电镜观察 ,确定筛选出的菌种为枯 草芽孢杆菌 。对其产的胶原蛋白酶进行分离和活 力测定 ,得到的酶活力为 44. 982 U/ mL 。电泳结 果证明 ,筛选出的枯草芽孢杆菌能够产胶原蛋白 酶 ,在底物与酶 1 ∶2 体积比混合反应 8 h 后 ,能 够使分子质量为 100 ku 左右的胶原蛋白水解成 8 ku左右的短肽 。
枯草芽孢杆菌生境多样 ,可利用的营养物质 种类十分丰富 ,这决定了其具有丰富的产酶系统 , 具备生产多种酶的应用潜力[3] 。研究表明 ,枯草 芽孢杆菌能够产生蛋白酶 、淀粉酶 、纤维素酶 、葡 聚糖酶 、植 酸 酶 、果 胶 酶 和 木 聚 糖 酶 等 十 几 种 酶[4] 。近年来 ,对枯草芽孢杆菌的研究已渐进到 遗传学与微生物学领域[5] ,但由枯草芽孢杆菌提 取出胶原蛋白酶的文章还未见报道 。本实验以海 产品市场附近的污泥为样品 ,筛选新的高产胶原
250
大 连 工 业 大 学 学 报
第 29 卷
将 ②号菌种通过显微镜观察 ,其细胞呈直杆 状 ,大小 (0. 8～1. 2) μm ×(1. 5～4. 0) μm ,单个 , 革兰氏染色阳性 ,着色均匀 ,产荚膜 ,周生鞭毛 ;芽 孢中生或近中生 ,小于或等于细胞宽 。
通过进一步的生理生化实验发现 , ②号具有以 下特性 :专性好氧 ,不具凝乳作用 ,过氧化氢酶实 验、硝酸盐还原实验、V2P 实验阳性 ;苯丙氨酸脱氢
2 结果与讨论
2. 1 胶原蛋白酶产生菌的筛选 2. 1. 1 分离纯化
通过初步筛选在 10 - 5 梯度下获得 3 个菌种 , 利用划线分离法分别对其进行分离纯化以获得单 个菌种 ,结果如图 1 所示 。
图 1 菌种图片
Fig. 1 st rain pict ures
2. 1. 2 菌种的确定 为了确定筛选的 3 个菌种是否为最后所需菌
力测定 ,得到的酶活力为 44. 982 U/ mL 。经 SDS2PA GE 凝胶电泳检测 ,该酶将分子质量为 100 ku 左右
的胶原蛋白水解成为 8 ku 左右的短肽 ,说明该酶能有效水解胶原蛋白 。
关键词 : 芽孢杆菌 ;胶原蛋白酶 ;筛选
中图分类号 : Q93
文献标志码 : A
Screening of collagenase2producing B acill us strain
0 引 言
胶原蛋白酶 (Collagenase , E. C 3. 4. 24. 3) 是 作用于胶原或其变性明胶而不作用其他蛋白质的 酶类 。它来源广泛 ,多种微生物以及动物的许多 组织细胞都可以产生胶原蛋白酶[1] 。目前已发现 溶组织梭菌 、溶藻弧菌等微生物能产生胶原蛋白 酶 ,并不断发现新的产胶原蛋白酶的微生物[2] 。
Abstract : Micro bes p roducing collagenase were isolated in glutin medium f ro m enriched cultivatio n of t he mud of fish market . Based on the higher ratio of hydrolyze loop to colony diameter ( HC) , a strain with 44. 982 U/ mL of collagenase activity was isolated. The strain should be Bacillus subtilis by the way of morphology and biochemistry characteristics. Further analysis showed that the crude enzyme with collagenolytic activity could hydrolyzed 100 ku of the native collagen into 8 ku of the small molecule substance. Key words : bacillus ; collagenase ; screen
酶实验 、卵黄卵磷脂酶实验阴性 ;分解葡萄糖产酸 不产气 ,能分解阿拉伯糖、甘露醇、酪素 、明胶淀粉 。
利用电镜观察 ,椭圆形 ,不明显膨胀 ,低凸起 , 表面皱褶 。
通过以上实验可以看出 , ②号菌种具有典型 的芽孢杆菌特征 ,由此可以确定筛选出的菌种为 枯草芽孢杆菌 。
表 1 筛选菌种的生理生化特性
种 ,对其进行生理生化鉴定 ,结果如表 1 所示 。由
表 1 可以看出 , ②号菌的明胶液化实验为阳性 ,说 明它所产生的酶能够使明胶液化 ,即能够水解明 胶 ,所以确定它为所需菌种 。
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
阳性
好氧 弱阳性
阳性
③号
1. 5
短杆 周围有绿色 ,圆形 ,表明光滑
阳性
好氧 阴性
阴性
2. 2 酶活力的测定 将 ②号菌经过明胶液体培养基培养 48 h ,提
取它所 产 生 的 胶 原 蛋 白 酶 并 测 其 酶 活 。测 得 A样 = 0. 296 , A对 = 0. 026 。计算得 ,酶活力 ( U ) =
酶活力单位定义 : 在 30 ℃、p H 为 7. 5 的条 件下 ,1 mL 酶液每分钟水解胶原蛋白产生相当于 1μmol 酪氨酸的酶量为 1 个酶活力单位 ( U ) ,即 1 mL 枯草杆菌蛋白酶液所具有的活性 。 1. 4 胶原蛋白酶法转化及产物
将胶原蛋白溶液与酶液 ,按体积比 1 ∶0. 5 、 1 ∶1和 1 ∶2 各配置 3 份 ,在 37 ℃条件下分别反 应 4 、8 和 24 h 。采用 SDS2PA GE 凝胶电泳测定 胶原蛋白酶水解情况及产物分子质量分布范围 。
收稿日期 : 2009210219. 基金项目 : 辽宁省教育厅 A 类项目 (2008063) .
作者简介 : 孙佳佳 (19852) ,女 ,硕士研究生 ;通信作者 :王红英 (19682) ,女 ,副教授.
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
将培养较好的平皿中的菌落点种到明胶培养 基上 ,28 ℃条件下培养 48 h 后 ,挑选出培养基上 产生透明圈明显的单菌落 。将此单菌落在明胶培 养基上重复培养 5 次 ,菌落生长状态稳定 ,由此证 明它的菌株传代稳定性好 。 1. 2. 5 菌种的确定
菌落形态观察参考《伯杰氏鉴定手册》及相关 生物实验教程 。各项生理生化指标采用细菌鉴定 常规方法 。
SUN J ia2jia , WANG Hong2ying , QIAN Si2ri2gu2leng , CHANG Kai
( School of Biological & Food Engineering , Dalian Polytechnic University , Dalian 116034 , China )
第4期
孙佳佳等 :产胶原蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选
249
培养基 。在 32 ℃摇床培养 48 h 后过滤 ,取滤液 。 1. 2. 3 初 筛
将滤液稀释 ,分别在 10 - 1 ～10 - 8 下各取1 mL 于明胶培养基用稀释涂布法在平皿上将菌液涂 匀 ,28 ℃条件下培养 48 h ,选择生长良好 、形态明 显并有透明圈菌落的平皿 。 1. 2. 4 复 筛
蛋白酶的微生物 ,并对其进行初步鉴定 。
1 材料与方法
1. 1 材 料 样品 ,采自大连市海产品批发市场附近的污泥。 主要试剂 :胶原蛋白粉末 ,本实验室自制 ;酪
蛋白 ,金铂铱科技有限公司 。 1. 2 产胶原蛋白酶菌的筛选 1. 2. 1 培养基
富集培养基 (100 mL ) :胶原蛋白 10 g ,酵母 膏 0. 01 g 。
明胶培养基 (100 mL ) : 明胶 2. 0 g ,蛋白胨 0. 5 g , KH2 PO4 0. 05 g , MgSO4 ·7 H2 O 0. 02 g , NaCl 0. 01 g ,p H 7. 2～7. 5 ,琼脂 1. 5 g 。 1. 2. 2 富集培养
取污泥 10 g 置于三角瓶中 ,加 100 mL 富集
第 29 卷第 4 期 Leabharlann Baidu010年7月
大连工业大学学报
Journal of Dal ian Polytechnic University
Vol . 29 No . 4 J ul . 2 0 1 0
文章编号 :167421404 (2010) 0420248203
产胶原蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选
孙 佳 佳 , 王 红 英 , 钱 斯 日 古 楞 , 常 凯
将通过生理生化实验筛选出的菌种 ,在明胶 液体培养基上 ,32 ℃条件下培养 48 h 。然后将培 养液 4 000 r/ min 离心 10 min ,取上清液 。冰浴 条件下 ,在上清液中缓慢加入硫酸铵至终质量分 数为 70 %。4 ℃静置过夜后 , 8 000 r/ min 离心 15 min ,收集沉淀 ,沉淀溶解到 p H 7. 5 缓冲溶液 中 ,透析 24 h 后冰箱保存备用 。 1. 3. 2 酶活测定
Tab. 1 Phenomenon of st rains’p hysiology2biochemist ry
菌种 透明圈比值
①号
1. 7
形态 短杆
生理生化特性 菌落特征 白色 ,圆形 ,表面光滑 ,边缘整齐 ,有菌丝出现
革兰氏染色 好氧性 MR 实验 明胶液化实验
阳性
好氧 阴性
阴性
②号
2. 8
短杆 两端钝圆 ,凸起 , 放射状 , 边缘叶状 ; 表面皱褶 , 无光 泽 ,灰白色 ,带有鳞片 ,不透明 ,无菌丝出现 ,味道较大
( 大连工业大学 生物与食品工程学院 , 辽宁 大连 116034 )
摘要 : 为了得到产胶原蛋白酶的微生物 ,以海产品市场附近采集的污泥为样品 ,经过富集培养后通过
明胶培养基进行筛选 ,获得 1 株产胶原蛋白酶的菌株 。通过形态观察和生理生化特征分析 ,以透明圈和
菌落直径之比 ( HC) 为检测指标 ,初步鉴定该菌株为芽孢杆菌属 。对它产生的胶原蛋白酶进行分离和活
另取 3 支试管 ,分别加入 1 mL 样品滤液 、对 照滤液和水 ,然后各加入 5 mL 0. 55 mol/ L 碳酸 钠溶液和 1 mL Folin2酚试剂 ,摇匀后在 30 ℃下 显色 15 min ,在 680 nm 处测吸光值 。以酪氨酸 为标准制作标准曲线 。
酶活力 ( U) = ( A样 - A对 ) ×K ×N ×V / t 式中 , A样 为样品液吸光度值 ; A对 为对照液吸光 度值 ; K 为吸光度值 1 对应的酪氨酸微克数 ; t 为 酶促反应时间 ; N 为酶液稀释倍数 (本实验 N 为 1) ;V 为酶促反应总体积 。
取 1 支试管 ,加入 2. 0 mL 0. 5 %的酪蛋白溶 液 ,于 30 ℃水浴中预热 5 min ,再加入 1. 0 mL 已 预热好的枯草杆菌蛋白酶液 ,水浴中准确保温
10 min后 ,立即加入 3. 0 mL 的 10 %三氯醋酸溶 液 ,摇匀静置 15 min ,过滤 ,收集的即是样品的滤 液 。另取一试管 ,先加入 1. 0 mL 酶液和3. 0 mL 的 10 %三氯醋酸溶液 ,再加入 2. 0 mL 0. 5 %的酪 蛋白溶液 ,混匀后于 30 ℃水浴保温10 min ,过滤 , 收集滤液作为对照溶液 。
44. 982 U/ mL 由于是粗酶液 ,含有其他酶类且稀释度较大 ,
所以酶活力较小 。 2. 3 胶原蛋白酶转化及其产物
将胶原蛋白溶液与酶液按比例混合 ,在一定 条件下反应 。采用 SDS2PA GE 凝胶电泳测定胶 原蛋白酶解情况及产物分子质量范围 。
3 结 论
实验结果表明 ,以海产品市场附近采集的污 泥为样品 ,经过富集培养基培养 48 h 后在 10 - 5 的 稀释度下利用明胶培养基筛选出能够产胶原蛋白 酶的菌种 ,并且菌种传代稳定性非常高 。通过生 理生化实验和电镜观察 ,确定筛选出的菌种为枯 草芽孢杆菌 。对其产的胶原蛋白酶进行分离和活 力测定 ,得到的酶活力为 44. 982 U/ mL 。电泳结 果证明 ,筛选出的枯草芽孢杆菌能够产胶原蛋白 酶 ,在底物与酶 1 ∶2 体积比混合反应 8 h 后 ,能 够使分子质量为 100 ku 左右的胶原蛋白水解成 8 ku左右的短肽 。
枯草芽孢杆菌生境多样 ,可利用的营养物质 种类十分丰富 ,这决定了其具有丰富的产酶系统 , 具备生产多种酶的应用潜力[3] 。研究表明 ,枯草 芽孢杆菌能够产生蛋白酶 、淀粉酶 、纤维素酶 、葡 聚糖酶 、植 酸 酶 、果 胶 酶 和 木 聚 糖 酶 等 十 几 种 酶[4] 。近年来 ,对枯草芽孢杆菌的研究已渐进到 遗传学与微生物学领域[5] ,但由枯草芽孢杆菌提 取出胶原蛋白酶的文章还未见报道 。本实验以海 产品市场附近的污泥为样品 ,筛选新的高产胶原
250
大 连 工 业 大 学 学 报
第 29 卷
将 ②号菌种通过显微镜观察 ,其细胞呈直杆 状 ,大小 (0. 8～1. 2) μm ×(1. 5～4. 0) μm ,单个 , 革兰氏染色阳性 ,着色均匀 ,产荚膜 ,周生鞭毛 ;芽 孢中生或近中生 ,小于或等于细胞宽 。
通过进一步的生理生化实验发现 , ②号具有以 下特性 :专性好氧 ,不具凝乳作用 ,过氧化氢酶实 验、硝酸盐还原实验、V2P 实验阳性 ;苯丙氨酸脱氢
2 结果与讨论
2. 1 胶原蛋白酶产生菌的筛选 2. 1. 1 分离纯化
通过初步筛选在 10 - 5 梯度下获得 3 个菌种 , 利用划线分离法分别对其进行分离纯化以获得单 个菌种 ,结果如图 1 所示 。
图 1 菌种图片
Fig. 1 st rain pict ures
2. 1. 2 菌种的确定 为了确定筛选的 3 个菌种是否为最后所需菌
力测定 ,得到的酶活力为 44. 982 U/ mL 。经 SDS2PA GE 凝胶电泳检测 ,该酶将分子质量为 100 ku 左右
的胶原蛋白水解成为 8 ku 左右的短肽 ,说明该酶能有效水解胶原蛋白 。
关键词 : 芽孢杆菌 ;胶原蛋白酶 ;筛选
中图分类号 : Q93
文献标志码 : A
Screening of collagenase2producing B acill us strain
0 引 言
胶原蛋白酶 (Collagenase , E. C 3. 4. 24. 3) 是 作用于胶原或其变性明胶而不作用其他蛋白质的 酶类 。它来源广泛 ,多种微生物以及动物的许多 组织细胞都可以产生胶原蛋白酶[1] 。目前已发现 溶组织梭菌 、溶藻弧菌等微生物能产生胶原蛋白 酶 ,并不断发现新的产胶原蛋白酶的微生物[2] 。
Abstract : Micro bes p roducing collagenase were isolated in glutin medium f ro m enriched cultivatio n of t he mud of fish market . Based on the higher ratio of hydrolyze loop to colony diameter ( HC) , a strain with 44. 982 U/ mL of collagenase activity was isolated. The strain should be Bacillus subtilis by the way of morphology and biochemistry characteristics. Further analysis showed that the crude enzyme with collagenolytic activity could hydrolyzed 100 ku of the native collagen into 8 ku of the small molecule substance. Key words : bacillus ; collagenase ; screen
酶实验 、卵黄卵磷脂酶实验阴性 ;分解葡萄糖产酸 不产气 ,能分解阿拉伯糖、甘露醇、酪素 、明胶淀粉 。
利用电镜观察 ,椭圆形 ,不明显膨胀 ,低凸起 , 表面皱褶 。
通过以上实验可以看出 , ②号菌种具有典型 的芽孢杆菌特征 ,由此可以确定筛选出的菌种为 枯草芽孢杆菌 。
表 1 筛选菌种的生理生化特性
种 ,对其进行生理生化鉴定 ,结果如表 1 所示 。由
表 1 可以看出 , ②号菌的明胶液化实验为阳性 ,说 明它所产生的酶能够使明胶液化 ,即能够水解明 胶 ,所以确定它为所需菌种 。
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
阳性
好氧 弱阳性
阳性
③号
1. 5
短杆 周围有绿色 ,圆形 ,表明光滑
阳性
好氧 阴性
阴性
2. 2 酶活力的测定 将 ②号菌经过明胶液体培养基培养 48 h ,提
取它所 产 生 的 胶 原 蛋 白 酶 并 测 其 酶 活 。测 得 A样 = 0. 296 , A对 = 0. 026 。计算得 ,酶活力 ( U ) =
酶活力单位定义 : 在 30 ℃、p H 为 7. 5 的条 件下 ,1 mL 酶液每分钟水解胶原蛋白产生相当于 1μmol 酪氨酸的酶量为 1 个酶活力单位 ( U ) ,即 1 mL 枯草杆菌蛋白酶液所具有的活性 。 1. 4 胶原蛋白酶法转化及产物
将胶原蛋白溶液与酶液 ,按体积比 1 ∶0. 5 、 1 ∶1和 1 ∶2 各配置 3 份 ,在 37 ℃条件下分别反 应 4 、8 和 24 h 。采用 SDS2PA GE 凝胶电泳测定 胶原蛋白酶水解情况及产物分子质量分布范围 。
收稿日期 : 2009210219. 基金项目 : 辽宁省教育厅 A 类项目 (2008063) .
作者简介 : 孙佳佳 (19852) ,女 ,硕士研究生 ;通信作者 :王红英 (19682) ,女 ,副教授.
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
将培养较好的平皿中的菌落点种到明胶培养 基上 ,28 ℃条件下培养 48 h 后 ,挑选出培养基上 产生透明圈明显的单菌落 。将此单菌落在明胶培 养基上重复培养 5 次 ,菌落生长状态稳定 ,由此证 明它的菌株传代稳定性好 。 1. 2. 5 菌种的确定
菌落形态观察参考《伯杰氏鉴定手册》及相关 生物实验教程 。各项生理生化指标采用细菌鉴定 常规方法 。
SUN J ia2jia , WANG Hong2ying , QIAN Si2ri2gu2leng , CHANG Kai
( School of Biological & Food Engineering , Dalian Polytechnic University , Dalian 116034 , China )
第4期
孙佳佳等 :产胶原蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选
249
培养基 。在 32 ℃摇床培养 48 h 后过滤 ,取滤液 。 1. 2. 3 初 筛
将滤液稀释 ,分别在 10 - 1 ～10 - 8 下各取1 mL 于明胶培养基用稀释涂布法在平皿上将菌液涂 匀 ,28 ℃条件下培养 48 h ,选择生长良好 、形态明 显并有透明圈菌落的平皿 。 1. 2. 4 复 筛
蛋白酶的微生物 ,并对其进行初步鉴定 。
1 材料与方法
1. 1 材 料 样品 ,采自大连市海产品批发市场附近的污泥。 主要试剂 :胶原蛋白粉末 ,本实验室自制 ;酪
蛋白 ,金铂铱科技有限公司 。 1. 2 产胶原蛋白酶菌的筛选 1. 2. 1 培养基
富集培养基 (100 mL ) :胶原蛋白 10 g ,酵母 膏 0. 01 g 。
明胶培养基 (100 mL ) : 明胶 2. 0 g ,蛋白胨 0. 5 g , KH2 PO4 0. 05 g , MgSO4 ·7 H2 O 0. 02 g , NaCl 0. 01 g ,p H 7. 2～7. 5 ,琼脂 1. 5 g 。 1. 2. 2 富集培养
取污泥 10 g 置于三角瓶中 ,加 100 mL 富集
第 29 卷第 4 期 Leabharlann Baidu010年7月
大连工业大学学报
Journal of Dal ian Polytechnic University
Vol . 29 No . 4 J ul . 2 0 1 0
文章编号 :167421404 (2010) 0420248203
产胶原蛋白酶枯草芽孢杆菌的筛选
孙 佳 佳 , 王 红 英 , 钱 斯 日 古 楞 , 常 凯