小鼠肝星状细胞的分离纯化新方法的建立与应用
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１ ５ 实验 方 法 ． １ ５ １ 细胞 的 分离 ．．
ｍ ａ公 司 ） 淋 巴细 胞 分 离 液 （ 国 医 学 科 学 院 生 物 工 程 医 学 研 、 中 究所）Ｄ 、 ＭＥ 培 养 液 干 粉 （ Ｂ Ｏ 公 司 ） 小 牛 血 清 （ 季 青 Ｍ ＧＩＣ 、 四 生 物 工 程 材 料 有 限 公 司 ） 鼠结 蛋 白 单 克 隆 抗 体 （ ＡＫ ） 、 Ｄ （ 公
（ ｌｅ ｅｏ ｅ ｓｒ ｎ ｆ ｃｅ ｃ ， ｅｎ ｎ Ｔｅ ｃ ｅ ｉｅ ｓｔ Ｗ ｅｎ ｎ， ｈ ｎ ｉ７ ４ ０ Ｃｈｎ ） Ｃｏｌｇ ｆ Ｃｈ ｍｉｔｙ ａ ｄ Ｌｉ ｅＳ ｉｎ ｅ Ｗ ｉａ ａ ｈ ｒＵｎ ｖ ｒｉ ｙ， ｉａ Ｓ ａ ｘ １ ０ ０， ｉａ Ａｂｔａ ｔＯｂｅ ｔ ｅ Ｔｏｄ ｖ ｌｐａｓｍ ｐｅ ｅ ｏ ｏ ｃａ ｄｅｆｃｅ ｔｍｅｈ ｄ ｆｒｉｏａｉｎ ｏ ｕ ｅｈ ｐ ｔｃｓｅｌｔ ｅｌ（ Ｃ） ｎ ｓｒ ｃ ： ｊ ｃｉ ｖ ｅ ｅｏ ｉ ｌ ，ｃ ｎ ｍｉ ｎ ｆｉｉｎ ｔ ｏ ｏ ｓ ｌｔ ｆｍｏ ｓ ｅ ａｉ ｔｌ ｅｃ ｌ ＨＳ ａ ｄ ｏ ａ ｓ
Ｄ Ｉ１ ． ９ ９ｊｉ ｎ １７ —１ ０ ２ ｌ． ９ ０ ２ Ｏ ：０ ３ ６ ／．ｓ ． ６ ３４ ３ ． ０ ２ ０ ． ０ ｓ
文献标识码 ： Ａ
文章 编 号 ：６ ３４ ３ （ Ｏ ２ ０ ０ ８ ０ ｌ ７ １ Ｏ ２ １ ） ９１ ２ ‘２ 。
Ｃｏ ｔ ｕ ｔｏ ｎ ｐｐ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｅ ｍ ｅ ｈｏ ｏｒ ｉ ｏ ａ ｉ ｎ ａ ｄ ｐ ｉ ｉ ａ ｉ ｎ ｏｆ ｍｏｕ ｅ ｈ ｐａ ｉ ｔ ｌａ ｅ ｃ ｌｓ ｎｓ ｒ ｃ ｉ ｎ ａ ｄ ａ ｌｃ ｔ ｏ ｆ ａ ｎ ｗ ｔ ｄ ｆ ｓ ｌ ｔｏ ｎ ｕｒ ｆ ｃ ｔ ｏ ｓ ｅ ｔｃ ｓ ｅ ｌ ｔ ｅ ｌ Ｌｉ Ｙａｌ ｎ ｉ
了一 种 实用 的 小 鼠 ＨＳ 分 离方 法 ， 用 于 肝 纤 维化 和 原 代 ＨＳ 的 生 物 学 行 为 研 究 。该 方 法 简便 、 用 、 Ｃ 可 Ｃ 实 高产 。 需 特 殊 设 备 ， 不 便
于 推 广 蕴 鼠
关 键 词 ： 否 细胞 ； 细 胞 分 离 ； 肝 硬 化 ； 肝 星 状 细 胞 枯
司 ） 油 红 ０（ 海 生 科 生 物 科 技 有 限 公 司 ） Ｄ Ｈａ ｋ （ 室 白 、 上 、 — ｎｓ本
配） 以及 ＤＡＰ 、 ｅ ａＦ ｕ ｒ５ ４标 记 的 羊 抗 鼠二 抗 （ ｌｃ ｌｒ Ｉ Ａｌｘ ｌｏ ９ Ｍｏｅ ｕａ
Ｐ ｏ ｅ ，ｎ ｉ ｏ ｅ ） 。 ｒ ｂ ｓ Ｉｖｔ ｇ ｎ 等 ｒ
１３ 主 要 仪 器 ．
超 净 工 作 台 、 荡 混 匀 器 、 ｅｉ ｃ ｉｅ系统 振 Ｍ ｄｍａｈｎ
Ｋｅ ｒ ｓ ｋ ｐ ｆ ｒｃ ｌ ； ｃ ｌ ｓ ｐ ｒ ｔｏ ｙ ｗｏ ｄ ： ｕ ｆ ｅ ｅｌ ｅｌ ｅ ａ ａ ｉ ｎ； ｌ ｅ ｉｒ ｏ ｉ ； ｈ ｐ ｔ ｔ ｌ ｔ ｅ ｌ ｓ ｉ ｒ ｃｒ ｈ ｓｓ ｖ ｅ ａ ｉ ｓ ｅｌ ｅ ｃ ｌ ｃ ａ
肝 星 状 细 胞 （ ｅ ａｉ ｓｅ ａｅｃｌ ＨＳ ） ｈ ｐ ｔ ｔｌ ｔ ｅｌ Ｃ 活化 是肝 纤 维 化 发 ｃ ｌ ， 生 、 展 的 主要 原 因 ， 活 化 产 生 的 细 胞 因 子 导致 肝 脏 细 胞 外 发 其 基 质 （ Ｃ ） 解 和 胶 原 纤 维 增 加 是 形 成 肝 纤 维 化 的 主 要 原 Ｅ Ｍ 降 因 ］ 。因 此 ， 究 其 活 化 机 制 及 其 抑 制 成 为 预 防 及 治 疗 肝 纤 研 维化 甚 至 肝 癌 的 主 要 突 破 口， Ｃ原 代 分 离 培 养 和 体 外 研 究 ＨＳ
由进 食 。
１ ２ 主要 试 剂 ． Ｐ ｏ ａｅ Ｅ（ ｒ ｋ公 司 ） Ｃｏｌｇ ｎ ｓ Ｓｇ ｒ ｎ ｓ Ｍｅｃ 、 ｌ ｅ ａｅ１ ｉ ａ Ｉ（
Ｉ ｎ ｓ １ ０ ｍ ｐ ． 。ＤＭＥ 细 胞 洗 涤 液 ： Ｄ ａｅ １ ＞Ｈａ ｋ 液 ０ Ｉ， Ｈ ７ ３ Ｍ 含 Ｎｓ ０ ｍｇ Ｉ，０ 小 牛 血 清 的 ＤＭＥ 细 胞 培 养 液 。所 有 用 液 均 需 过 ／ ２ Ｍ 滤除菌 ， 并且 ３ ７℃ 预 热后 使 用 。
ｔ ｏｎ ｔ ｕ ｔｃ ｌ ｍ ｏ ｌｆ ｅ ｅ ｃ ｐａ ｉ ｉ ｏｓｓ Ｍ ｅ ｈ ｄ Ｓｉ ｌ ｅｌｓ ｐ ｎｓｏ ｓ ｐ ｅｐ ｒ ｄ ｂ ｅ ｇｅ ｔｏ ｕｓｎ ｎ ｙ ｅ ｏ ｃ ｓ ｒ ｃ ｅ１ ｄｅ ｏｒｒ ｓ ａｒ ｈ ｏｎ ｈｅ ｔｃ ｆｂｒ ｉ． ｔ ｏ ｓ ｎｇｅ ｃ ｌ ｕｓ ｅ ｉｎ ｗａ ｒ ａ ｅ ｙ ｐｒ ｄｉ ｓ ｉ ｎ， ｉｇ ｅ ｚ ｍ ｐｅ ｆ ｉｎ， ｄｅ ｕａ ｅｄｉ ｓ ｉｎ ｂｙ ｖｉ ａ ｉ ｎｄ ｕｔｌｚ ｔｏ ｄｉ ａ ｈｉ ｙ ｔ ｍ ．ｔ ＳＣ ｅ ｅ ｉｏ ａ ｅ ｙ ｍ ｏｎ ａｙ ｒｇ ａ ｉｎｔｃ ｎｔ ｉｕ— ｒｕｓｏ ａ ｑ ｔ ｇｅ ｔｏ ｂｒ ｔｎｇ ａ ｉｉａ ｉｎ ｏｆｍｅ ｍ ｅ ｎｅｓ ｓ ｅ ｔ ｗ ｒ ｓ ｌ ｔ ｄ ｂ ｏｌ ｅ ｒ ｄ ｅ ｅ ｒｆ ｇ ｔｏ ｔ ｙ ｐｈｏ ｙ ｉ ｅｌｓ ｐａ ａ ｉ ｇ ｍ ｅ ｉ ｍ ｒ ｃ ｌ ．Ｒｅ ｕｌｓ Ｔ ｈ ｒ ｓ ｅ ｅｌｎｕ ｂｅ ａ ｂｏ ａ ｉｎ ｗｉｈ ｌ ｍ ｃ ｔｃ ｃ ｌ ｅ ｒ ｔｎ ｄ ｕ ｄｉｅ ｔｙ ｓ ｔ ｅ ｈａ ｖｅ ｔｄ ｃ ｌ ｍ ｒｗ ｓａ ｕｔ１× １ ｆ ａ ｈ ｔ ｉｅ， ｏｒｅ ｃ ｗｏ ｍ ｃ ０ ｗ ｉｈ ｃ ｌ ｍ ｏ ｉｉｙ ｒ ｔ ２ ， ｔ ｒ ｉ ｄ ｂｙ ｔｙｐ ｎ ｂ ｕｅ ｅ ｌ ｓｏ ｔ ｉ ｎｇ ｔ ｅｌ ｔｌｔ ａ ｅｏｆ９ ｄｅ ｅ ｍ ｎｅ ｒ ａ ｌ ｘｃ ｕ ｉｎ ｓ ａｎｉ ．Ｏｒｇｉａｌｙ ｉｏｌｔ ｄ Ｈ ＳＣ ｓ ｕｅ ｕ ｌ ｏｒ ｓ ｅ ｔ ｎｄ ｒ ｉ ｎ ｌ ｓ ａ ｅ ｉｓ ｄ ｈｌ ｅ ｆｕ ｅ ｃ ｎ ｕ ｅ
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（ 麦 Ｄ ｋ ） 电 子 天平 、 温 垂 直 立 式 离 心 机 、 置 显 微 镜 、 丹 ａｏ 、 低 倒 荧 光 显 微 镜 、 温水 浴 振 荡 器 、 浴 锅 等 。 恒 水
１ ４ 主要 用 液 ． Ｄ－ ｎ ｓ液 ： １０ ４ ｇ Ｉ． Ｈａ ｋ ＫＣ ． ／ ＫＨ ０ ０ ／ Ｐ（ ． ６ｇ Ｉ，
液 直接 铺 梯 度 ， 用 单 层 梯 度 离心 法 一 步 分 离 ＨＳ 。 结 果 两 只 小 鼠 ＨＳ 得 率 可 达 １ Ｏ 个 ， 盼 蓝 染 色 显 示 细 胞 活 率 达 采 Ｃ Ｃ １ ｘ 台
９ 。初 分 离 的 ＨＳ ２ Ｃ在 ３ ８ｎ 激 发 光 下 自发 蓝绿 色荧 光 ， 红 染 色及 结 蛋 白免 疫 细 胞 化 学 染 色鉴 定 纯度 达 ９ 。结 论 建 立 ２ ｍ 油 Ｏ
１ ５ １ １ 麻 醉 与 消 毒 用 ２ 戊 巴 比 妥 钠 按 ４ ／ ｇ腹 腔 ．．． ０ ｍｇ ｋ 注射 小 鼠 。麻 醉 后 常规 固 定 ， 小 鼠 于超 净 台 内 ， ５ 酒 精 消 置 ７ 毒腹 部 ， 外 线 照 射 ２ ～ ３ ｎ 紫 Ｏ ０ ｍｉ 。 １ ５ １ ２ 灌 流 “ ” 切 口打 开腹 腔 ， 肠 管 于 腹 腔 左 侧 ， ．．＿ 十 字 推 暴
国际检验医学杂志 ２１ 年 ５月第 ３ ０２ ３卷第 ９ 期
ｌｔ ａ ｄ ｎ Ｌ ｂＭｅ Ｊ
！， ０ 塑！ ｖ ：
・
基础 实验 研 究论著 ・
ห้องสมุดไป่ตู้
小 鼠 肝 星 状 细 胞 的 分 离 纯 化 新 方 法 的 建 立 与 应 用
李 亚琳△
（ 南师 范 学院化 学与 生命 科 学 学院 ， 渭 陕西渭 南 ７ ４ ０ ） １ ０ ０
１ １ 实验 动物 ．
Ｓ Ｆ级 雄 性 昆 明 小 白 鼠 ６只 （ 质 量 ２ ～ ３ Ｐ 体 ５ Ｏ
０ ２ｇ Ｉ， ． ／ ＤＮａｅ０ ０ ／ Ｃ Ｃ１ ０ ２ ／ 含 ２ ４ｇ Ｉ ｓ ． ２ｇ Ｌ， ａ ２ ． ２ｇ Ｉ， ． ／ Ｈｅ ｅ ｐ ｓ的
ｇ 由第 四军 医大 学 实 验 动 物 中心 提 供 ， 予 普 通 饲 料 喂 养 ， ） 均 自
摘 要 ： 的 介 绍 一 种 简便 、 济 、 产 的 小 鼠肝 星状 细胞 （ Ｃ 分 离方 法 ， 目 经 高 ＨＳ ） 为肝 纤维 化 的 研 究提 供 细 胞 模 型 。方 法 参 照
国 内 外 方 法 并加 以 改 良 ， 用 酶 灌 注 预 消 化 及 随 后 的 震 荡充 分 消 化 ， 并 Ｍｅ ｉ ｅ ｉｅ系统 制 成 单 细 胞 悬 液 。 用人 淋 巴 细 胞 分 离 采 合 ｄｍａｈｎ
因 而 也 显 得 越 来 越 重 要 【 。本 文 介 绍 一 种 简 单 的 小 鼠 ＨＳ ３ ］ Ｃ原 代分离及纯化培养方法 。
１ 材 料 与 方 法
素钠 ４０Ｉ ｐ ． 。酶 灌 注 液 ： 霉 蛋 闩 酶 Ｅ １ ３ｇ Ｉ Ｔ ０ Ｕ，Ｈ ７ ４ 链 ． ／ ，型胶
原酶 ０ ２ ／ ， ａ １０ ２ ／ 含 ２ ４ ／ ｅ ｅ 的 Ｉ Ｈ ｎ ｓ ． ５ｇ Ｌ Ｃ Ｃ ２ ． ２ｇ Ｉ ， ． Ｉ ｐ ｓ ３ ａ ｋ 液 ｇ Ｈ － １ ０ｍＩ ｐ ＇ ３ ０ Ｈ ７ 。振荡 消 化 液 ：型胶 原酶 ０ ２ ／ 链 霉 蛋 白 Ｅ ， ． Ｉ ． ５ｇ Ｉ ，
Ｎａ ． ／ Ｎａ Ｃ１ ０ｇ Ｉ， ＨＣＯａ ． ５ｇ ｉ， ２ Ｏ１ ． ５ ／ 预 灌 注 ８ ３ ／ Ｎａ ＨＰ ０ ３ｇ ｌ。 ０ ０
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ｍ ａ公 司 ） 淋 巴细 胞 分 离 液 （ 国 医 学 科 学 院 生 物 工 程 医 学 研 、 中 究所）Ｄ 、 ＭＥ 培 养 液 干 粉 （ Ｂ Ｏ 公 司 ） 小 牛 血 清 （ 季 青 Ｍ ＧＩＣ 、 四 生 物 工 程 材 料 有 限 公 司 ） 鼠结 蛋 白 单 克 隆 抗 体 （ ＡＫ ） 、 Ｄ （ 公
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文献标识码 ： Ａ
文章 编 号 ：６ ３４ ３ （ Ｏ ２ ０ ０ ８ ０ ｌ ７ １ Ｏ ２ １ ） ９１ ２ ‘２ 。
Ｃｏ ｔ ｕ ｔｏ ｎ ｐｐ ｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｅ ｍ ｅ ｈｏ ｏｒ ｉ ｏ ａ ｉ ｎ ａ ｄ ｐ ｉ ｉ ａ ｉ ｎ ｏｆ ｍｏｕ ｅ ｈ ｐａ ｉ ｔ ｌａ ｅ ｃ ｌｓ ｎｓ ｒ ｃ ｉ ｎ ａ ｄ ａ ｌｃ ｔ ｏ ｆ ａ ｎ ｗ ｔ ｄ ｆ ｓ ｌ ｔｏ ｎ ｕｒ ｆ ｃ ｔ ｏ ｓ ｅ ｔｃ ｓ ｅ ｌ ｔ ｅ ｌ Ｌｉ Ｙａｌ ｎ ｉ
了一 种 实用 的 小 鼠 ＨＳ 分 离方 法 ， 用 于 肝 纤 维化 和 原 代 ＨＳ 的 生 物 学 行 为 研 究 。该 方 法 简便 、 用 、 Ｃ 可 Ｃ 实 高产 。 需 特 殊 设 备 ， 不 便
于 推 广 蕴 鼠
关 键 词 ： 否 细胞 ； 细 胞 分 离 ； 肝 硬 化 ； 肝 星 状 细 胞 枯
司 ） 油 红 ０（ 海 生 科 生 物 科 技 有 限 公 司 ） Ｄ Ｈａ ｋ （ 室 白 、 上 、 — ｎｓ本
配） 以及 ＤＡＰ 、 ｅ ａＦ ｕ ｒ５ ４标 记 的 羊 抗 鼠二 抗 （ ｌｃ ｌｒ Ｉ Ａｌｘ ｌｏ ９ Ｍｏｅ ｕａ
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１３ 主 要 仪 器 ．
超 净 工 作 台 、 荡 混 匀 器 、 ｅｉ ｃ ｉｅ系统 振 Ｍ ｄｍａｈｎ
Ｋｅ ｒ ｓ ｋ ｐ ｆ ｒｃ ｌ ； ｃ ｌ ｓ ｐ ｒ ｔｏ ｙ ｗｏ ｄ ： ｕ ｆ ｅ ｅｌ ｅｌ ｅ ａ ａ ｉ ｎ； ｌ ｅ ｉｒ ｏ ｉ ； ｈ ｐ ｔ ｔ ｌ ｔ ｅ ｌ ｓ ｉ ｒ ｃｒ ｈ ｓｓ ｖ ｅ ａ ｉ ｓ ｅｌ ｅ ｃ ｌ ｃ ａ
肝 星 状 细 胞 （ ｅ ａｉ ｓｅ ａｅｃｌ ＨＳ ） ｈ ｐ ｔ ｔｌ ｔ ｅｌ Ｃ 活化 是肝 纤 维 化 发 ｃ ｌ ， 生 、 展 的 主要 原 因 ， 活 化 产 生 的 细 胞 因 子 导致 肝 脏 细 胞 外 发 其 基 质 （ Ｃ ） 解 和 胶 原 纤 维 增 加 是 形 成 肝 纤 维 化 的 主 要 原 Ｅ Ｍ 降 因 ］ 。因 此 ， 究 其 活 化 机 制 及 其 抑 制 成 为 预 防 及 治 疗 肝 纤 研 维化 甚 至 肝 癌 的 主 要 突 破 口， Ｃ原 代 分 离 培 养 和 体 外 研 究 ＨＳ
由进 食 。
１ ２ 主要 试 剂 ． Ｐ ｏ ａｅ Ｅ（ ｒ ｋ公 司 ） Ｃｏｌｇ ｎ ｓ Ｓｇ ｒ ｎ ｓ Ｍｅｃ 、 ｌ ｅ ａｅ１ ｉ ａ Ｉ（
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１ ４ 主要 用 液 ． Ｄ－ ｎ ｓ液 ： １０ ４ ｇ Ｉ． Ｈａ ｋ ＫＣ ． ／ ＫＨ ０ ０ ／ Ｐ（ ． ６ｇ Ｉ，
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９ 。初 分 离 的 ＨＳ ２ Ｃ在 ３ ８ｎ 激 发 光 下 自发 蓝绿 色荧 光 ， 红 染 色及 结 蛋 白免 疫 细 胞 化 学 染 色鉴 定 纯度 达 ９ 。结 论 建 立 ２ ｍ 油 Ｏ
１ ５ １ １ 麻 醉 与 消 毒 用 ２ 戊 巴 比 妥 钠 按 ４ ／ ｇ腹 腔 ．．． ０ ｍｇ ｋ 注射 小 鼠 。麻 醉 后 常规 固 定 ， 小 鼠 于超 净 台 内 ， ５ 酒 精 消 置 ７ 毒腹 部 ， 外 线 照 射 ２ ～ ３ ｎ 紫 Ｏ ０ ｍｉ 。 １ ５ １ ２ 灌 流 “ ” 切 口打 开腹 腔 ， 肠 管 于 腹 腔 左 侧 ， ．．＿ 十 字 推 暴
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小 鼠 肝 星 状 细 胞 的 分 离 纯 化 新 方 法 的 建 立 与 应 用
李 亚琳△
（ 南师 范 学院化 学与 生命 科 学 学院 ， 渭 陕西渭 南 ７ ４ ０ ） １ ０ ０
１ １ 实验 动物 ．
Ｓ Ｆ级 雄 性 昆 明 小 白 鼠 ６只 （ 质 量 ２ ～ ３ Ｐ 体 ５ Ｏ
０ ２ｇ Ｉ， ． ／ ＤＮａｅ０ ０ ／ Ｃ Ｃ１ ０ ２ ／ 含 ２ ４ｇ Ｉ ｓ ． ２ｇ Ｌ， ａ ２ ． ２ｇ Ｉ， ． ／ Ｈｅ ｅ ｐ ｓ的
ｇ 由第 四军 医大 学 实 验 动 物 中心 提 供 ， 予 普 通 饲 料 喂 养 ， ） 均 自
摘 要 ： 的 介 绍 一 种 简便 、 济 、 产 的 小 鼠肝 星状 细胞 （ Ｃ 分 离方 法 ， 目 经 高 ＨＳ ） 为肝 纤维 化 的 研 究提 供 细 胞 模 型 。方 法 参 照
国 内 外 方 法 并加 以 改 良 ， 用 酶 灌 注 预 消 化 及 随 后 的 震 荡充 分 消 化 ， 并 Ｍｅ ｉ ｅ ｉｅ系统 制 成 单 细 胞 悬 液 。 用人 淋 巴 细 胞 分 离 采 合 ｄｍａｈｎ
因 而 也 显 得 越 来 越 重 要 【 。本 文 介 绍 一 种 简 单 的 小 鼠 ＨＳ ３ ］ Ｃ原 代分离及纯化培养方法 。
１ 材 料 与 方 法
素钠 ４０Ｉ ｐ ． 。酶 灌 注 液 ： 霉 蛋 闩 酶 Ｅ １ ３ｇ Ｉ Ｔ ０ Ｕ，Ｈ ７ ４ 链 ． ／ ，型胶
原酶 ０ ２ ／ ， ａ １０ ２ ／ 含 ２ ４ ／ ｅ ｅ 的 Ｉ Ｈ ｎ ｓ ． ５ｇ Ｌ Ｃ Ｃ ２ ． ２ｇ Ｉ ， ． Ｉ ｐ ｓ ３ ａ ｋ 液 ｇ Ｈ － １ ０ｍＩ ｐ ＇ ３ ０ Ｈ ７ 。振荡 消 化 液 ：型胶 原酶 ０ ２ ／ 链 霉 蛋 白 Ｅ ， ． Ｉ ． ５ｇ Ｉ ，
Ｎａ ． ／ Ｎａ Ｃ１ ０ｇ Ｉ， ＨＣＯａ ． ５ｇ ｉ， ２ Ｏ１ ． ５ ／ 预 灌 注 ８ ３ ／ Ｎａ ＨＰ ０ ３ｇ ｌ。 ０ ０
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