基因工程讲PPT课件

二、外源DNA导入哺乳动物细胞的方法
1．磷酸钙转染技术
(1) 磷酸钙转染的基本步骤
通过磷酸钙DNA共沉淀，将外源基因导入哺 乳动物细胞的技术程序，最初是由Graham等 人于1973年创立的。应用这种方法，能够将任 何的外源DNA有效地导入培养的哺乳动物细胞， 目前仍被许多实验室广泛地使用。磷酸钙转染 法的基本操作过程包括：
3．二氢叶酸还原酶基因选择系统
(1) 基本原理
二 氢 叶 酸 还 原 酶 (dihydrofolate reductase ， DHFR)在真核细胞的核苷酸生物合成中起着重要 的作用，它催化二氢叶酸(DHF)还原成四氢叶酸 (THF)。这个反应过程受到叶酸的类似物氨基蝶 呤(aminopterin，APT)和氨甲蝶呤(methotrexate， MTX)的竞争性抑制。
胞能逾越氨基蝶呤的抑制作用，继续合成出 这些脱氧嘌呤三磷酸(dATP和dGTP)。
由于在HAT培养基中补加有外源的胸苷， 所以TK+细胞通过胸苷激酶的作用可把它 合成为dTTP，继续存活下去；而TK-细胞
则不会发生这种合成，因而死亡。把正常 的tk基因导入TK-细胞，它们也就照样能 够存活下去。所以使用HAT培养基，能够 选择出由tk基因转化而来的TK+细胞。
2) 另一个dhfr显性选择标记是位于细菌 抗药性因子R388பைடு நூலகம்的dhfr基因。它编码 的二氢叶酸还原酶，实际上就可以抗 MTX的抑制作用。
4．氯霉素乙酰转移酶基因选择系统
氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyl transferase，CAT)是由大肠杆菌Tn9转座子 上的cat基因编码的，它能够催化乙酰基团从 乙酰辅酶A转移到氯霉素分子上，导致一个 或两个羟基发生乙酰化作用，从而使其失去 活性。这个基因可以作为检测外源基因导入 真核细胞的一种十分敏感的标记基因，尤其 是适用于瞬时表达的研究。
哺乳动物基因转染实验常用的显性选择标记
1．嘌呤和嘧啶的生物合成
（1）嘌呤的生物合成
APRT：腺嘌呤磷酸核糖基转移酶；HGPRT：次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基 转移酶；XGPRT：黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶。
（2）嘧啶的生物合成
2、胸苷激酶基因选择系统
(1) TK-细胞
胸苷激酶(thymidin kinase，TK)是核苷酸合成 代谢途径中的一种酶，能够把胸苷转换为胸苷一 磷酸。在单纯疱疹病毒(HSV)中发现的胸苷激酶 的编码基因(tk)，几乎在所有的真核细胞中都能 有效地表达。正是由于这种缘故，以确定哺乳动 物基因转移可能性为目标的大多数早期实验，都 是采用这个基因作为遗传选择标记。
目前最常用的一种TK- 细胞是小鼠L细 胞的TK-突变株。这种突变株的优点是产
生回复突变的频率相当低，而且容易被外 源DNA所转化，所以使用起来很方便，即 便在不使用tk基因作选择标记的情况下， 也可用作受体细胞。
(2) HAT选择法
由 于 选 择 TK+ 细 胞 的 培 养 基 含 有 次黄嘌呤(hypoxanthine)、氨基蝶呤 (aminopterin) 和 胸 苷 (thymidine) ， 所以叫做HAT选择法。
在胸苷激酶基因选择系统中，首先得建立具TK-表 型的细胞株。这可以通过诱变加选择的程序获得。
具体的做法：把细胞培养在补加有一种胸苷类似物 5-溴尿嘧啶脱氧核苷(BUdR)的培养基中，在胸苷激 酶的催化下，BUdR便掺入到细胞的DNA分子上， 致使DNA复制出现错误。具有BUdR-DNA的细胞对 UV特别敏感，被迅速地杀死，而少数突变的TK-细 胞便能够存活下来。应用这种方法已经分离到许多 种培养细胞的TK-突变体。
第四章 哺乳动物基因工程
一、哺乳动物基因转移的遗传选择标记
迄今为止，已知的绝大多数的哺乳动物病毒载 体，除了牛乳头病毒载体外，都得附加上标记基 因，才能进行有效的选择。
常用的这些标记基因有：胸苷激酶基因(tk)、 二氢叶酸还原酶基因(dhfr)、氯霉素乙酰转移酶 基因(cat)、细菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移 酶基因(Eco-gpt)以及细菌的新霉素磷酸转移酶基 因(Eco-neo）等。
如果细胞的培养基中含有这些抑制物， 例如氨甲蝶呤，其浓度只要达0.1µg／ml， 就会阻断核苷酸生物合成，最终导致细 胞死亡。
（2）常用的基因:
1) 小鼠3T6成纤维细胞的突变系3T6—400 来源的突变dhfr基因。由它合成的突变二 氢叶酸还原酶与正常酶相比，同MTX的结 合能力下降了270倍。因此，用突变细胞 呈抗性反应的MTX浓度，就可以把野生型 细胞杀死，达到了显性选择的目的。如果 把突变基因dhfrMTX导入正常的细胞，转 化子也就获得了抗性。
基本原理：如果用叶酸的类似物氨基蝶呤 (APT)处理细胞，二氢叶酸还原酶便被抑制， 培养基中的还原辅助因子四氢叶酸因得不到 补充而逐渐耗尽，于是从dUMP合成dTTP， 以及dATP和dGTP的重新合成便因此被阻断。 但次黄嘌呤是dATP和dGTP补救合成途径的 一种底物，培养基中补加有此种物质时，细
(3) 共转化选择
1) 共转化选择的基本过程
HAT 选 择 法 可 以 用 来 分 离 以 tk 基 因 作 选择标记的外源DNA转化的受体细胞。
在磷酸钙沉淀中，两种DNA分子的混 合物，能够同时转化受体细胞。根据这 种共转化现象，结合磷酸钙共沉淀技术， 人们可以将无选择标记的DNA同具tk选 择标记基因的DNA进行混合转化，发展 出了共转化选择体系，从而解决了不具 tk选择标记基因的转化子的选择问题。
5．氨基糖苷磷酸转移酶基因选择系统
氨基糖苷磷酸转移酶(APH) 基因也经常用Econeo表示，它是氨基糖苷类抗菌素的抗性基因， 所编码的APH酶可以使此类抗菌素，如G418失 去活性。
氨 基 糖 苷 抗 菌 素 G418 ， 即 3’- 脱 氧 链 霉 胺 (3’deoxystreptamine)，在结构上同卡那霉素、新霉 素及庆大霉素十分相似。它通过抑制70S核糖体 的功能而阻断真核细胞中的蛋白质合成，造成细 胞死亡。因此，为我们提供了一种不需要特殊突 变细胞的显性选择系统。