同步荧光光谱法

合集下载
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
与 成正比
拉曼光与入射光之间的频率差称为拉曼位移 R
R RayRom
精品课件
当 R 或 R 时
固定能量的同步荧光光谱可消除瑞利散射 和拉曼散射,而固定波长的同步荧光光谱只能消除 瑞利散射,使拉曼散射拉宽。二者皆能降低光谱的 复杂性,提高选择性。
F a
b
c
精品课件
二、同步扫描仪器设备 1、固定波长的荧光光谱的获得
的,最好得到另外的信息: (1)先得到任何一组分的稳态荧光光谱,然后调
节检测器相角至该荧光光谱和混合物的荧光 光谱重叠,则可得到与另一组分正交的相角。 (2)使用任何一组分的纯溶液以确定检测器的相 角。
精品课件
当用相灵敏检测器在各种不 同检测器相角测绘样品的相灵敏荧光 光谱。对于单一化合物,其荧光峰波 长基本上保持不变而与检测器相角无 关。如果不是均匀的发射,则荧光峰 随着检测器相角而改变,在不同检测 器相角得到的相灵敏光谱是鉴别不均 匀发射的有力工具。
在松弛过程中,能量有所降低,因而发 射向长波位移。
时间分辨荧光法可记录不同时间的发射 光谱,因而可测量松弛时间。
精品课件
例1 4-氨基苯邻二酰亚胺(4-AP)的丙醇溶 液
在不同的温度下的时间分辨的荧光
光谱室图温下, -132℃ 荧光光谱与时间t无关
在-77K,荧光光谱与t 有关
在 4ns, 溶剂还未重新取向 在23ns, 溶剂取向已完成
精品课件
3、相分辨荧光法与时间分辨荧光法比较 用于荧光参数测量的仪器可分为两大类
稳态测量
steady-state
时间依赖的测量 dependent
time
相分辨荧光法与时间分辨荧光法本质上 都是时间依赖或时间分辨的测量。
精品课件
(1)仪器 时间分辨荧光法的局限性
a. 仪器常常非常复杂,常局限于有关专家使用; b. 灵敏度常低于稳态测量。
激发光源、时间延迟设备、激发单色器、 样品池、荧光单色器及设有门控的检测器
1、激发光源 短脉冲的激发光源
闪光灯
氮闪光灯 线 氢闪光灯
氘闪光灯
几条高强度射 连续线 强度低
精品课件
氮分子激光器
337.1 nm
激光器 氩离子激光器
351 nm
染料激光器 波长
所需
光子通量大、峰值功率高、单色性好、发 生的光脉冲持续时间短,激光荧光法具有 较高的灵敏度和选择性。
精品课件
例2 2-对-苯甲基萘-6-磺酸盐染料
溶剂
甘油
温度 A图 4℃
B图 12.2 ns
1.8 ns, 8.0 ns, 12.2 ns 57℃ 1.8 ns, 8.0 ns,
精品课件
4-5
相分辨荧光法
( Frequency-Domain Fluorometry
/Phase-Modulation Fluorometry)
荧光寿命为荧光强度衰变到初始值的 1/e
所需要的时间。
精品课件
特点: 采用适当的激发光源和检测体系,可以得
到在固定波长的荧光强度—时间曲线和在固定 时间的荧光发射光谱。
(1)可以对混合物中光谱重叠但寿命差异的组 分进行分辨;
(2)可消除杂质与背景荧光;
(3)可测量溶剂松弛的时间。
精品课件
二、时间分辨仪器设备
50nm
(5)尿液中肾上腺素和去甲肾上腺素的同时测定
10n0m
精品课件
稳态测量 荧光测量
时间依赖的测量
总结:
精品课件
4-4 时间分辨荧光法 (Time – Domain Fluorometry)
(Time – Resolved Fluorometry)
精品课件
一、时间分辨法原理
用短脉冲光源激发的荧光体群体,随时间而 衰变,其衰变率为
相分辨法的优点 a. 仪器类似于稳态测量的仪器,使用简单; b. 灵敏度高; c. 数据处理快。
精百度文库课件
(2)测量参数
a. F(t)-t 曲线
时间分辨
b. m. .
相分辨
精品课件
(3)从实验的观点,相分辨有下列优点: ➢ 在时间分辨的方法中,测量的延迟信号的去 卷积对于计算测量系统的限定时间的响应是必要的, 而相分辨法不受此限制; ➢ 相分辨法允许不同方向的直接测量。如在各
精品课件
(2)定量依据
I S (e,x e) m K E C X (e) E x b M (e) m (1)
E X 激发光谱强度分布
E M 发射光谱强度分布
emex
ISKC EX b(em )EM(em ) ISKC EX b(ex )EM(ex)
(2) (3)
(2)同步扫描激发波长时的发射光谱
激发光的光强度被正弦调制,其角调制频率为, 则发射光也同样被调制。由于吸收和发射之间的 时间延迟,调制的发射光比起激发光在相上延迟 了角。但发射光的调制比起激发光的调制小一些, 也即是发射光的改变部分的相对幅度比起激发光 要小些。
精品课件
m B/ A Ba b/a Ab
— 去调制因素
激发光和发射光的光强正弦调制
精品课件
2、固定能量的同步荧光光谱 constant energy synchronous luminescence (CESL)
Ray
Roman
固定能量的同步荧光光谱,是指在同步扫描 过程中,使激发波长与发射波长之间保持着 固定的能量差。
精品课件
( 1 1 )107 常数 ex em
表示波数差 c
NOR. EM. SCAN
精品课件
em /nm
1、固定波长的同步荧光光谱 (Constant wavelength synchronous luminescence , CWSL)
(1) 在同步扫描中,使激发波长与发射波长保
持固定的波长间距,即emex
常数。将同步荧光信号对发射或激发波长测绘荧 光光谱图,则为固定波长的同步荧光光谱。
精品课件
The objective of both timedomain and frequency-domain fluorometry is to recover the parameter describing the timeresolved decay.
精品课件
一、相分辨法原理 1、单指数衰变的荧光 当样品被激发光激发而发射荧光时,如
dN(t)(k)N(t)
dt
N(t)
dN(t)(k)
t
dt
N0 N(t)
0
受激分子的寿命 (k)1
t
N(t) N0e
F(t)N0et F0et
精品课件
用 F(t) 或 N(t) 对 t 作

F(t) or N(t)
1/e
lg F ( t )
or
lg N ( t )
t
t
lgF(t)lgF0(tlge)
m 越小 发射光被调制的幅度越小
随 的增大而增大,寿命越长,延迟的 越大。
当荧光分子的寿命越长,发射相对于激发延迟 的时间就越长。
精品课件
2、多指数衰变的荧光
如果样品中含有两种荧光体,或者单一 荧光体而进行进一步激发态反应,则荧光是双 指数衰变。如果进行多步反应,则荧光是多指 数衰变。
由 和 m 所计算的 是表观荧光寿命。
(2)二苯并呋喃中痕量咔唑和蒽 5nm
精品课件
(3)酪氨酸和色氨酸严重重叠
CWSL
60nm的同步荧光 15nm的征同步荧光

色氨酸的光谱特 酪氨酸的光谱特
30nmor 70nm 的二阶导数同步荧光可

Trp 和 Tyr 分
50nm辨同步荧光可对Trp、Tyr、Phe分辨
精品课件
(4)维生素B1、B2混合物中维生素B1的测定 用铁氰化钾将B1氧化硫胺荧
精品课件
2、检测器 如光电倍增管 带有门控的
精品课件
三、时间分辨荧光的分析应用
荧光体的荧光寿命的测定 时间分辨荧光光谱 荧光发射的衰变曲线
精品课件
1、荧光体混合物中两组分的同时测定
例 用8-羟基喹啉-5-磺酸(R)同时测定Al 和Ga
15.20 ml 样品 + 1 ml 0.045% R +
2 ml 20% NH4Ac (or 20% NH4Cl ) 调 pH 至4.5,稀释至25 ml
比较(2)和(5)的荧光强度得Ga的含量
精品课件
2、芳基的测定 例 用ps双色荧光法对卤素芳族化合物光离解
作用所产生的芳基进行检测
(1)用25ps,266nm 激光脉冲使1-(氯甲基)萘,
1-(溴甲基)萘, 2-(氯甲基)萘, 2-(溴甲 基)萘等化合物离解产生芳基。
(2)在延迟60ps后,用25ps,355nm激光脉冲激 发芳基的荧光,产生橙色荧光,600nm, 10ns,如图所示。
相灵敏荧光光谱,即为在固定时间的 荧光光谱。
精品课件
若样品溶液中含有 A、B 两种荧光体, 它们的荧光寿命分别为A和B。
F (, t ) F A () m A st i n A ) F B m ( B st i B n ) (
F ( ,D ) F A ( ) m A cD o A ) s F B ( ) ( m B cD o B )s(
精品课件
(4) 的选择
只有当 恰好相当于某吸收带和其发射带之
间波长间距时,才能观察到同步信号。
= 斯托克斯位移 (发射波长与激发波长 之差 ) 与狭缝宽度 d 的大致原则:
只受瑞利: ae d/2
当同时受瑞利和拉曼散射干扰
ae
d/2
ae
d1 2(r e)
a — 测定 波
r — 拉曼散射光的波长
对于以光栅为单色器的荧光分光光度计, 只要分别设置激发和发射两个单色器所需的起 始波长,并使它们以同样的速率进行扫描,便 可进行固定波长同步扫描荧光测定。
2、固定能量同步扫描 是非线性的可变角同步扫描,需通过微
处理机控制而加以实现。
精品课件
三、应用
1、在多环芳烃分析中的应用 减小光谱的重叠
(1)固定波长同步荧光法用于煤中多环芳烃 的测定
4-3 同步荧光光谱 法
( Synchronous Fluorescence)
精品课件
一、同步荧光分析原理
同步荧光技术是同时扫描激发单色器 和发射单色器波长的情况下来测绘荧光光谱图。 由测得的荧光强度信号对发射或激发波长作图, 称为同步荧光光谱。
精品课件
ex
nm
NO FLUORE
NOR. EX. SAN
精品课件
tan
m(122)12
在测量相角()或去调制因素(m)之
后,可以计算该荧光体的荧光寿命。相 分辨法是荧光寿命的测量方法之一。
精品课件
、m与 的关系如下:
m
10 MHz 30 MHz
(ns)
30 MHz 10 MHz
(ns)
精品课件
m 随 的增大而下降
m=1
发射光与激发光的调制幅度相同
如 i D 90,则该组分的发射被抑制
DA90 F (,A 9 ) 0 F B () m B siB n A )( DB90 F (,B 9 ) 0 F A () m A siB n A )(
精品课件
要得到混合物中组分A的稳态光谱,须把 检测器相角调节至和组分B正交。这是很费时
氘灯激发
测定荧光强度—时间曲
线
精品课件
(1)测定荧光衰变曲线
Al – R Ga – R
10.8ns 4.3ns
6.5ns
可利用上述两个荧光化合物的差异 对它们进行同时测定。
精品课件
(2)计算含量
铝配合物和镓配合物的 衰变曲线
铝配合物和镓配合物的 对数衰变曲线
比较(1)和(4)的荧光强度得Al的含量
苊(Ace ),2,3-苯并芴(BF),蒽 (Ant),
苯并芘(Bap), 苝(Per) 用标准加入法计算2,3-苯并芴
(2)低温固定能量同步荧光法
精品课件
煤液化样品中各种有机物 的同步荧光光谱
煤液化样品的固定波长同步 荧光光谱
精品课件
2、同步荧光法在医药检验方面的应用 (1)违禁药品中苯丙胺和吗啡加奎宁麦角酸 二乙酰胺的测定
精品课件
(a)和(c)一致,是1-萘甲基所致 (b)和(d)一致,是2-萘甲基所致
3、溶剂松弛时间的分辨测量
许多分子在基态时具有从中等到大的 偶极矩,在激发态时偶极矩发生变化,从而引起 周围溶剂分子中电子的重排和溶剂分子围绕激发 态溶质分子偶极的重新定向,这个过程称为溶剂 松弛,这个过程所需的时间叫溶剂松弛时间。
如采用相灵敏检测器的相荧光计,
单一荧光体
F (t) 1 m L m si tn ) (
m L — 激发光的调制度(或振幅) m — 去调制因素
精品课件
对于相灵敏检测器
F (,D ) k( F )co D s )(
F ( ) — 稳态荧光光谱 D — 检测角度
在不同相角 D 测定荧光光谱,称为
(3)同步扫描发射波长时的激发光谱
精品课件
(3)同步荧光光谱的特点
a. 同步光谱与激发光谱及发射光谱都有关系。 它同时利用了化合物的吸收特性和发射特性, 因而使光谱分析的选择性得到改善。
b. 有利于多组分混合物的分析。同步荧光光 谱可以把强带增强而减小弱带的干扰。
c. 可消除 Raylei 干扰,使 Roman 强度降低 且拉宽。
相关文档
最新文档