图解引物设计

2013-10-27

实例图解简并引物设计（By Raindy）

【絮语】

设计一对合适的引物是PCR扩增目的基因成功的关键，但许多人往往过度依赖 Primer Premier（以下简称PP）或Oligo 等引物设计软件，有时候引物没设计成，却身陷软件之中无法自拔。其实，不论特异性引物或简并引物，只要掌握了几个关键点，手动也可以设计出一对好引物。如果不是大批量设计引物或设计复杂的引物序列，下面的四个常用工具即可轻松胜任引物设计任务。下文以马铃薯Y病毒CP基因简并引物设计为示例，分享一些个人经验，希望对初学者能起个抛砖引玉作用。受专业领域及水平所限，文中有不当之处，敬请各位同仁、童鞋批评指正。

【相关工具】

（1）MEGA5-多重序列比对、选取基因区域、序列编辑

（2）DNAMAN8-检测两引物的互补性

（3）Oligo Calc-评估引物的属性

（4）Web Logo 3-直观显示简并碱基

-------------------------------------------------【华丽分割线】------------------------------------------------- 【基本原则】

设计一对好的引物，归结起来就是5′端引物、3′端引物之间以及两者与模板的关系处理得恰到好处：

（1）两引物的序列要与模板的序列紧密互补；

（2）两引物不能在模板的非目的位点发生错配；

（3）两引物之间尽量减少二聚体或发夹结构生成。

【延伸原则】

（1）引物长度：常用为 18-27bp，最大不可超过38bp，否则容易导致延伸温度过高，不适合DNA聚合酶反应；

（2）GC含量：一般介于40%-60%之间，且两个引物之间的GC含量相差不能过于悬殊；

（3）碱基分布：随机分布最佳，但避免连续的GC，GC富集区容易导致错误引发反应。【特别注意】

5′端引物的作用主要限定PCR产物的长度，对扩增特异性影响不大；引物的延伸是从3′端开始的，所以3′端引物是影响特异性扩增的最关键因素，因此，在实际设计过程中，设计3′端引物时，需要综合考虑以下几个内容：

（1）不要终止于密码子的第 3 位

（2）末位碱基避免使用碱基 A

（3）避免出现3个以上连续的G或C，如GCG或CCC或GGG

（4）ΔG的绝对值不可超过 9

（5）与非特异扩增的序列同源性不能超过70%或有连续8个互补碱基同源

（6）不能进行任何修饰

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【设计流程】

【示例背景】

马铃薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）是侵染马铃薯、烟草、辣椒等茄科作物并造成严重危害的病毒之一，广泛分布全球各马铃薯种植区。RT-PCR技术具有高度的特异性和灵敏性等特点，已经成为 PVY检测最常见的方法。但由于PVY株系分化严重，不断有新的重组株系产生，单一的特异性引物无法适应PVY不同株系的检测需求，需要设计一对简并引物以能够满足生产上的检测需求。

【详细图解】

1.序列准备：

（1）GenBank 下载PVY全基因组序列

（2）由于基因序列比较大，且数量多，推荐用MAFFT多重序列比对

（3）扩增片段区域选择，CP基因长度及位置如下图所示：

先将光标定位在第一条序列任意位置，然后在左下角"Site"处直接输入CP基因上游分界点位置（8391）后回车。接着点击“Speicaes/Abbrv”和8391那一列的交界点时按下键盘上“Shift”不放，移动光标到“1”那一列，此时点击鼠标右键“Delete”删除冗余序列。

裁切后得到CP基因编码区序列，“Export Alignment”导出CP基因序列（推荐fasta格式）。

2. 引物设计

推荐先设计3′端引物，至于原因，上面的【特别注意】中已提到，这里不再赘述。

（1）选择引物序列

综合考虑引物设计原则及特别注意，在CP基因3'端位置选取一段合适的序列

（784-803bp），804bp位置为A且是第三个密码子位置，所以弃去末位的A碱基。

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PS：是否位于密码子的第3位，可以通过“Tranlated Protein Sequences”-“DNA sequences”切换查看，如下图，CP基因的末端3个碱基是终止密码子所在的位置，A是第三位密码子。

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（2）生成 Seq Logo

选定序列后，参考上述步骤，删除冗余序列，保留CP基因3'端序列，同样导出为Fasta 文件，将序列粘贴入Web Logo3（/create.cgi）的文本框内或

直接上传序列文件，设置相关参数后点击“Create”生成 Seq Logo格式的文件CP-3.fas。

参数设置： “Output format”（输出格式）推荐用“PDF”，“Color scheme”（颜色方案）

推荐用“Classic (NA)”，设置完毕，点击右下角“Create Logo“即可得下图的Seq Logo 格式文

件。

通过Web Logo 生成的多重比对图片可以很直观得到3'端序列为

CTTGGAGT(C/T/G)AA(G/A)AACATGTG，查询简并碱基代码表（下图），可知C/T/G=B，G/A=R，简并度=3 ×2 =6，整理后3′端序列为 CTTGGAGT B AA R AACATGTG，故而需要合

成的3′端引物序列： CACATGTT Y TT V ACTCCAAG （与原序列是反向互补关系）。