溃疡性结肠炎药效评价动物模型介绍
结肠炎动物模型具体步骤及方法
结肠炎动物模型具体步骤及方法预览说明:预览图片所展示的格式为文档的源格式展示,下载源文件没有水印,内容可编辑和复制结肠炎动物模型具体步骤及方法原型物种人来源三硝基苯磺酸钠(TNBS)导致的结肠炎模式动物品系SPF级SD大鼠，健康，6~8W，雄性，体重为180g-200g。
实验分组实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组。
实验周期4-6 weeks建模方法模型制作方法：动物造模当日计为实验第1天，各组动物造模前禁食不禁水24 h，乙醚吸入麻醉，将一直径2.0 mm、长约12 cm的塑胶管由肛门轻缓插入大鼠体内深约8 cm，缓慢注入一定浓度的TNBS的乙醇溶液，1 min之内完成。
灌药完毕后，缓慢拔出塑胶管，用手捏住肛门，提起大鼠尾部，持续倒置3min，避免造模试剂流出，使造模剂充分渗入大鼠肠腔内。
对照组动物使用等体积的生理盐水，按上述同样操作进行灌肠。
各组动物均正常饲养。
TNBS的乙醇溶液（将体积分数为5%的TNBS水溶液与无水乙醇以体积2:1混合）现配现用。
应用用于结肠炎药物的研发和机理的研究1. 一般情况观察及体重记录一般观察：观察各组动物的情况，若出现意外症状，记录情况并及时反馈；记录可能出现的死亡率。
体重：从给药前一天开始，每三天称量并记录各组动物体重，直至给药结束，绘制体重变化曲线。
实验过程中体重共记录10次体重统计、变化曲线作图。
2. 肠组织取材及大体评分：各组动物安乐死后，解剖时截取自肛门向上的整段结肠组织测量结肠长度进行宏观评价：各个结肠组织带标尺拍照，记录原始的大体形态，依照评分标准进行评分。
结肠组织大体评分标准如下：0分无损伤1分充血但没有溃疡2分充血而且肠壁变厚但没有溃疡3分有一处小溃疡，最长径约0-1cm4分溃疡较大，最长径约1-2cm5分溃疡较大，最长径>2cm对应以上评分标准，记录每份结肠组织的具体评分。
评分标准参考文献：Wallace JL, Keenan CM. An orally active inhibitro of leukotriene synthesis accelerates healing in a rat model of colitis. Am J Physiol,1990 258:G527-G5343.3 结肠组织病理染色：组织做以下处理：每个结肠均分成3段，每个动物取材的位置要尽量一致（不管剪切位置是否有病理损伤尽量保持一致）。
小鼠乙酸诱导肠炎模型
小鼠乙酸诱导肠炎模型溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性炎症，其原因不明，是非特异性肠道炎症，其病变部位好发于直肠和结肠，多表现为腹泻、腹痛、黏液脓血便、里急后重，具有易反复、病程迁延、不易治愈的特点。
可能与细菌感染、食物或异物损伤、长期饲喂精饲料、滥用抗生素类药物及精神障碍等有一定的关系。
在我国，UC的发病率有逐年增高的趋势，逐渐引起了人们的重视。
到目前为止溃疡性结肠炎的病因及发病机制尚未完全明确，研究表明肠黏膜出现慢性炎症可能与基因、环境、微生物及免疫功能的失调等多种因素相互作用有关。
1.实验动物SPF级Balb/C小鼠，雄性，周龄为4w~6w，体重为20g~22g。
2.实验分组：实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。
3.实验周期7d4.建模方法1. 小鼠术前12 h禁食，自由饮水。
2. 3%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉(40mg／kg)小鼠，小鼠取头低尾高体位，将聚乙烯导管经肛门缓慢插入结肠3cm并经其注入5％乙酸0．4 mL，捏紧小鼠肛门倒提30 s后，注入生理盐水lmL冲洗，正常组注入等量生理盐水对照，造模结束后让小鼠平躺，自然清醒，常规饲养。
3. 7d后摘眼球取血，静止30min，4℃离心机3000r/min离心10min，分离出上层血清，置-80℃冰箱保存备用。
处死小鼠，取出肛门至盲肠末端的整个结肠和直肠段，预冷生理盐水冲洗干净，滤纸吸干，肉眼观察各组小鼠结肠的大体改变，测量结肠长度及记录湿重。
剪取病变最严重的结肠1 cm，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片(厚4um)，HE染色。
观察病理改变，其余结肠置于～80℃冰箱备用。
5.模型评价1. 疾病活动指数(DAI)评分：造模后观察小鼠每日腹泻、血便及体重变化情况，并记录小鼠的一般情况。
造模后，模型组小鼠体重明显下降，出现身体蜷缩，毛发竖立，行动迟缓，食欲减退，大便稀溏的症状。
大鼠溃疡性结肠炎模型的建立与观察-PPT课件
二、结果
3.循环免疫复合物: 在第31 天测定淋巴细胞转化率的同时,测定循环免疫复合物。 正常对照组为3.7士1.7; 单纯免疫组为9.3 士4.6; 免疫同时加服活菌组为11.0士3. 4。 免疫组与正常对照组比较差异显著(P<0.05)。 单纯免疫组与加服活菌组比较无明显差异(P>0.0 5)。
二构完整,除2份标本粘膜层可以看 到极少数的嗜酸性粒细胞浸润外,其余标本无异常。 而在免疫的70 只鼠中,均可见粘膜及粘膜下层水肿,炎细胞浸润及 血管炎改变。 粘膜内可见多处隐窝脓疡及溃疡形成;溃疡有的深达粘膜下层或达 浆膜,甚至形成粘膜下或浆膜下脓肿。 无论是否加服活菌,病理改变基本相同,并随时间的延长,溃疡的形 成率在增加。比较各段结肠病变情况,可见病变在横结肠与降结肠 更为多见,但与升结肠比较并无明显统计学差异。肝、心、脾、肺、 肾等重要脏器未发现有意义的病理变化。
2.细菌菌株: 取一只健康大鼠的结肠内容物,划线于伊红—美蓝平板,37 °C培 养24 小时,取典型菌落扩增,并作数值鉴定,确定为大肠杆菌后,冰 箱保存备用。 免疫前取菌种扩增,用福马林杀死细菌,生理盐水洗两次并调浓度 为1.2 x108/ ml
一、材料与方法
3.免疫过程: 免疫动物分别于第1、1 0、17、24 天共接受4次免疫。 第一次于后足肠处注射细菌悬液0.2m l; 第2、3次分别于腹部甸背部皮下多点注射0.4ml和0.6ml; 第4次腹腔内注射1.2m l,其中半数动物在第2 次免疫前给口服活 菌1.5m l(浓度同前)。 4.检查项目与方法: 用常规方法每3天检查便潜血一次,用形态法测定淋巴细胞转化率; 用比浊法测定循环免疫复合物; 在不同时间处死动物,取各段结肠各0.5c m 及肝、心、脾、肺、 肾等脏器作病理切片,HE染色、光镜观察。
溃疡性结肠炎相关实验研究进展述评(一)
溃疡性结肠炎相关实验研究进展述评(一)【关键词】溃疡性结肠炎相关实验研究进展述评慢性溃疡性结肠炎（UC）是以腹泻、黏液脓血便、腹痛和里急后重等为主要症状，以结肠黏膜慢性炎症和溃疡形成为病理特点的一种消化道疾病。
随着人们生活水平的不断提高和饮食结构、习惯的改变，其发病率呈现逐年上升趋势。
本病治愈难度大，且愈后易再发，与结肠癌的发病存在一定关系，被世界卫生组织列为现代难治病之一。
近年对于本病的中西医实验研究取得了较大的进展。
现针对国内近7年的实验研究大体进展综述如下。
1动物模型的建立理想的慢性溃疡性结肠炎实验动物模型应具备如下特点：（1）肠道炎症的发生，以及病程、病理生理学改变与UC相同或相似；（2）实验动物应具有明确的遗传背景；（3）以已知抗原能诱导免疫反应；（4）用传统UC治疗药物治疗有效；（5）实验动物在没有遗传或化学药物干预情况下，能自发形成肠道炎症。
实际上很少有如此理想的动物模型，目前所制作和使用的肠道炎症实验动物模型一般所选用的动物为大鼠（SD或Wistar大白鼠）、小鼠、豚鼠；实验模型分为4类，即化学药物诱导型动物模型3类和依据中医证型特点开发的实验研究模型1类。
化学药物诱导型动物模型3类。
（1）葡聚糖硫酸钠(dextransulfatesodium，DSS)〔1〕：DSS是一种由蔗糖合成的硫酸多醣体，具有与肝素相同的抗止血和抗凝血作用，其诱发的病理改变更接近人类UC特点，通过不同时间段给予BALB/c小鼠5%DSS溶液和蒸馏水，造建急性、慢性、急慢性交替期UC模型，已取得较理想的病理结果。
（2）过氧化亚硝酸钠法〔2〕：过氧化亚硝酸钠诱导大鼠溃疡性结肠炎建立WistarUC实验模型，结果显示，应用过氧化亚硝酸钠造模具有制作简便、重复性好、制作成本低廉的优点，其形态学改变能反映UC发病的部分本质机制。
（3）三硝基苯磺酸（TNBS）／乙醇模型〔3〕：TNBS与大分子组织蛋白合成一种抗原物质致T细胞致敏，溶解与半抗原结合的自身细胞，导致炎症的发生。
消化系统疾病动物模型
消化系统疾病动物模型（一）胃肠疾病动物模型1、急性胃炎动物模型（1）酸制剂诱发急性胃炎模型：Wistar大鼠，雄性，300g，大鼠禁食24h，在清醒状态下，用下述试剂或物质灌胃：①水杨酸制剂（如20mmol／L阿司匹林或水杨酸溶液）按100mg／kg体重灌胃；②2ml10mmol／L的醋酸或2ml不同浓度的盐酸（1、10、100mmol／L）；③2ml同种动物胆汁或2mmol／L的牛磺胆酸；④2ml15％的乙醇。
4h 后处死动物，剖检可见胃内发生急性弥漫性炎症改变。
胃粘膜表面有浅表糜烂、出血，粘膜层内见中性粒细胞浸润。
（2）胆汁反流性胃炎模型：碱性肠液倒流入胃，刺激胃粘膜可引起炎症，即胆汁反流性胃炎。
常见于原发性或继发性幽门功能紊乱或胃切除手术后。
本法取上部小肠的碱性肠液注入已结扎幽门的同种大鼠胃内，使之对胃粘膜产生持续刺激，形成胃炎。
动物选取雄性Wistar大鼠，体重180～220g,制备上部小肠液，向胃内注入小肠液，2 ml/只（正常对照组注入2 ml生理盐水）。
缝合腹壁，腹腔注射阿托品5 mg/kg体重，以抑制胃液分泌，利于胃粘膜损伤模型的形成。
处死大鼠，开腹，结扎贲门，取出胃，沿胃大弯剪开。
用滤纸吸干表面水分，立即称量胃重，以胃湿重/体重之比（胃系数）表示胃水肿程度。
肉眼观察并计数整个胃粘膜出血点数，作为损伤指数。
模型组动物胃系数和损伤指数明显增加，肉眼观察模型组胃粘膜充血、水肿，皱襞减少，颜色暗红，并有大量散在出血点。
2、慢性胃炎动物模型（1）大鼠慢性萎缩性胃炎模型酗酒、用药不当、饮食习惯不良、幽门螺杆菌感染、自身免疫等是此病的主要病因。
组织病理学是评价造模成功的最主要指标，主要观察和测量胃粘膜厚度、粘膜肌层厚度、腺体数量、壁细胞数量、固有层炎细胞浸润程度和肠化生发生率等。
综合法一：胆汁（去氧胆酸钠）+热水+主动免疫综合法二：去氧胆酸钠+热糊+主动免疫综合法三：去氧胆酸钠+酒精+氨水+吲哚美锌3、动物胃粘膜肠上皮化生模型（1）X线胃局部照射诱发胃粘膜肠化生模型：选用5～8周龄的Wistar 或JCL/SD大鼠。
常用溃疡性结肠炎动物模型的及比较
介质的分泌所产生的综合效应。
或脓血便及精神萎糜，活动减少，毛发色泽暗淡等全身改变。
UC 动物模型的建立对研究 UC 病因、病变发展规律、诊断、治 Allgayer 等[3]提出溃疡性结肠炎模型的发作、缓解期的大致分界点为
疗以及新药研发等方面具有重要意义。目前国内外学者对 UC 动物 3 周左右。该模型有操作简便、重复性好、经济实用、造模时间短等
模型的建立进行了较为深入的研究，包括化学物诱导、免疫-化学物 特点，而且与人类 IBD 类似，比较适合于对防治药物的筛选和研究。
Immunization and chemistry model are good at the research of immunization and chronic period. The operations of ACOH model and TNBS model are
sasy, and DNCB model and Immunization and chemistry model need more longer cycle.
性炎症反应链造成了组织损伤，可概括为两个阶段：第一阶段为肠 后，在直肠 6～8cm 处注入含三硝基苯磺酸（25～150mg·kg－1）的 25%
道黏膜的原发性损害，第二阶段为炎症反应扩大。可以认为 UC 的 乙醇溶液，倒置 30s。
炎症和组织损伤是由免疫反应的扩大、各种细胞的活化和多种炎性
造模后引起慢性炎症性肠疾病（IBD）。造模后 1～3 天出现稀便
2 二硝基氯苯法
累及直肠和乙状结肠，也可遍及整个结肠，主要侵犯大肠黏膜与黏
二硝基氯苯是一种有毒的有机化学试剂，与细胞组织蛋白结合
膜下层，呈阶段性和弥漫性分布。以腹泻、腹痛及黏液脓血便等消化 时起半抗原作用，能诱发免疫反应。方法以大鼠为例，大鼠颈背部剃
实验性溃疡性结肠炎动物模型的造模选择
实验性溃疡性结肠炎动物模型的造模选择摘要溃疡性结肠炎（CU）在欧美国家相当常见。
国内虽未见明确的流行病学报道，但近年发病率似有上升趋势。
虽有感染、遗传、精神因素、过敏、免疫等多种发病学说，但其病因、发病机制、药物治疗机制，尚未完全清楚［1］。
中医中药在辨证分型基础上组方，口服及局部治疗CU 有较好的疗效［2］。
选择合适的动物疾病模型，探索中医中药治疗机制对深入研究CU具有重要意义。
关键词结肠炎；溃疡性；疾病模型、动物；动物、实验1动物及类型1.1动物选择自发性溃疡性结肠炎在马、猴、猪等动物中都有散发，因病因不明，病情轻重不一，难以作为动物模型为实验所用［3］，目前国内外常用大白鼠、豚鼠、家兔为实验动物，药物学方法最常选用白鼠。
1.2模型类型①西医病理模型：以CU患者临床症状及病理特征为参照，运用药物、免疫等方法作用于动物，造成与人类疾病相近似的动物模型；②中医“证”与西医“病”相结合的模型：运用综合方法复制既符合中医证型又符合西医病症的CU模型。
如湿热型溃疡性结肠炎模型［4］2造模方法常用方法大致可以分为3类：药物学方法、免疫学方法和复合法。
2.1药物学方法2.1.1乙酸刺激法［4-7］乙酸是一种有机酸，呈弱酸性，具有使血管通透性增加，激活激肽，促进纤维蛋白水解及干扰凝血过程等作用，对动物胃肠粘膜有刺激作用，可以引起粘膜损伤。
1970年开始用于制作CU的鼠模型，至今仍广泛使用。
方法：SD大白鼠，体质量200g～250g，雌雄兼用，造模前禁食17h～24h，经肛门注入5g·L-1肥皂水1.5mL，约30min后用20g·L-1戊巴比妥钠经腹腔麻醉，插入直径３mm的聚乙烯纤维导管至大鼠直肠内，深度约5cm～7cm，注入50mL·L-1或100mL·L-1乙酸溶液1.5mL，准确计时10s～20s后再注入生理盐水3mL～5mL冲洗，以消除乙酸的作用。
之后，常规饲养。
溃疡性结肠炎动物模型构建方法的研究进展
溃疡性结肠炎动物模型构建方法的研究进展田家华1，索小涛1，马晨曦1，郑丽红2，王海强11 黑龙江中医药大学附属第一医院消化二科，哈尔滨150040；2 黑龙江中医药大学附属第四医院消化内科摘要：溃疡性结肠炎（UC）是一种病因不明的慢性非特异性肠道炎症性疾病，其确切发病机制尚不完全清楚。
目前，UC诊断尚无金标准，主要结合临床表现、影像学检查、结肠镜检查及肠组织病理检查等综合分析。
但UC病程往往较长，病情迁延难愈，缓解期与活动期交替出现，病例收集和随访难度较大。
而UC动物模型可模拟UC肠黏膜屏障损伤、肠道炎症状态及菌群紊乱情况。
因此，通过构建合理的动物模型对揭示UC的发病机制、探索高效的治疗策略至关重要。
目前，UC动物模型的构建方法主要有诱导法、基因敲除法和联合法。
根据诱导剂不同，诱导法可分为化学药物诱导法、微生物诱导法和食物诱导法。
根据敲除基因不同，基因敲除法可分为屏障蛋白基因敲除法和抗炎因子基因敲除法。
而联合法一般采取两种及以上方法构建UC动物模型。
这些模型构建方法各有利弊，应根据自身实验需求和实验条件选择最适合的动物模型。
关键词：溃疡性结肠炎；动物模型；诱导法；基因敲除法；联合法doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2024.13.027中图分类号：R574.6；R-332 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2024）13-0111-04溃疡性结肠炎（UC）是一种病因不明的慢性非特异性肠道炎症性疾病，病理改变主要累及结肠或直肠的黏膜层和黏膜下层，临床表现为黏液脓血便、间断性腹泻、腹痛、里急后重等。
有研究表明，UC可增加自身免疫性肝病、结直肠癌、贫血等疾病的发生风险，并可引起焦虑、抑郁等精神心理疾病，给患者造成沉重的经济负担和巨大的心理压力［1-3］。
目前，UC的确切发病机制尚不完全清楚，可能与肠道微生态失衡、自身免疫功能紊乱以及家族遗传等因素有关［4］。
UC诊断尚无金标准，主要结合临床表现、影像学检查、结肠镜检查及肠组织病理检查等综合分析。
美沙拉嗪对小鼠溃疡性结肠炎模型中Let-7i-5p
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-α的mRNA 水平和血清中的蛋白水平显著上调,MSLZ 和Let -7i -5p 抑制剂处理均能抑制IL -1β和TNF -α的表达水平㊂结论:在TNBS /㊃945㊃ʌ基金项目ɔ河北省中医药管理局科研计划项目,(编号:2024178)ʌ通讯作者ɔ王㊀婧乙醇诱导的UC小鼠模型中,MSLZ可以抑制结肠组织中和血清中Let-7i-5p的表达㊂此外,MSLZ还通过抑制UC小鼠的TLR4/MyD88依赖性通路来抑制炎症因子的释放㊂ʌ关键词ɔ㊀溃疡性结肠炎;㊀美沙拉嗪;㊀Let-7i-5p;㊀TLR4/MyD88依赖性通路ʌ文献标识码ɔ㊀A㊀㊀㊀㊀㊀ʌdoiɔ10.3969/j.issn.1006-6233.2024.04.04Regulatory Mechanism of Mesalazine on Let-7i-5p/TLR4/MyD88Signaling Pathway in a Mouse Model of Ulcerative ColitisMAO Zhenzhen,LIU Jing,ZHANG Chenhua,et al(Cangzhou Central Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine/CangzhouSecond People's Hospital,Hebei Cangzhou061000,China)ʌAbstractɔObjective:To investigate the regulatory mechanism of mesalazine(MSLZ)on Let-7i-5p and TLR4/MyD88signaling pathway in a mouse model of2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)-in-duced ulcerative colitis(UC).Methods:A UC model was established using the TNBS/ethanol method.Forty -four male mice were randomly divided into four groups:control group,model group,MSLZ group,and Let-7i-5p inhibitor group,with11mice in each group.Mice were gavaged or intraperitoneally injected with corre-sponding drugs or saline for14consecutive days.The expression levels of Let-7i-5p in colon tissues and ser-um of mice were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction(qRT-PCR).The pathological changes of colon tissues were observed by hematoxylin and eosin(HE)staining under a microscope.The mR-NA and protein levels of TLR4/MyD88signaling pathway-related genes in colon tissues of mice were detected by qRT-PCR,Western blot,and immunohistochemistry,respectively.The expression levels of TNF-αand IL-1βin mouse serum were detected by ELISA.Results:According to the disease activity index(DAI),co-lon damage score,and pathological lesion score,the mouse UC model was successfully established.The ex-pression levels of Let-7i-5p in colon tissues and serum of mice in the model group were significantly higher than those in the control group(P<0.0001).Compared with the model group,both MSLZ and Let-7i-5p in-hibitor treatment could significantly inhibit the expression of Let-7i-5p(P<0.0001).Compared with the control group,the mRNA and protein levels of TLR4/MyD88signaling pathway-related genes(including TLR4,MyD88,TRAF-6,and NF-κB)in colon tissues of mice in the model group were significantly upregu-lated.MSLZ and Let-7i-5p inhibitor treatment could significantly inhibit the expression of these genes,and the inhibitory effect of MSLZ was slightly stronger than that of Let-7i-5p pared with the control group,the mRNA levels of IL-1βand TNF-αin colon tissues and the protein levels in serum of mice in the model group were significantly upregulated.MSLZ and Let-7i-5p inhibitor treatment could inhibit the expres-sion levels of IL-1βand TNF-α.Conclusion:In the TNBS/ethanol-induced UC mouse model,MSLZ can inhibit the expression of Let-7i-5p in colon tissues and serum.In addition,MSLZ can also inhibit the release of inflammatory factors by inhibiting the TLR4/MyD88-dependent pathway in UC mice.ʌKey wordsɔ㊀Ulcerative colitis;㊀Mesalazine;㊀Let-7i-5p;㊀TLR4/MyD88-dependent pathway㊀㊀溃疡性结肠炎(UC)是一种炎症性肠病(IBD),与自身免疫性异常密切相关[1]㊂目前,氨基水杨酸㊁类固醇激素和免疫抑制是治疗UC最常用的药物[2]㊂然而,这些药物的治疗效果并不令人满意㊂此外,长期使用甚至会导致严重的不良反应㊂美沙拉嗪(MSLZ)作为一种新型的5-氨基水杨酸控释制剂,是UC治疗的首选药物[3]㊂特别适用于不能耐受柳氮磺胺吡啶的UC患者的急性发作㊂MSLZ的具体药理功能尚未完全阐明㊂有研究表明,MSLZ主要作用于肠道炎症黏膜,从而抑制前列腺素和白三烯的合成[4]㊂MSLZ清除氧自由基,抑制肠黏膜内脂肪酸,降低肠道通透性㊂同时,它对肠壁炎症具有显著的抗炎作用[5]㊂然而, MSLZ对免疫系统的调节作用却鲜有报道㊂有研究表明,MSLZ下调了结肠组织中核因子kappaB(NF-κB)的表达,从而减少了结肠中炎症细胞因子的产生[6]㊂此外,其他细胞因子或通路也可能参与了MSLZ的抗㊃055㊃炎调控㊂目前,Toll样受体4/髓系分化初级反应88 (TLR4/MyD88)依赖的信号通路在UC的发病机制中受到广泛关注[7]㊂在UC中存在许多差异表达的miR-NA,包括Let-7i-5p㊂在血红素诱导的炎症模型中,负载Let-7i-5p的脂质体靶向并减少TLR4的表达,从而产生抗炎信号传导㊂在本研究中,我们首先建立了2, 4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇诱导的小鼠UC模型㊂我们的目的是检测MSLZ对UC的抗炎作用,并阐明Let-7i-5p和TLR4/MyD88依赖的通路是否参与了这一过程㊂本研究结果可为MSLZ治疗UC提供理论依据㊂1㊀材料与方法1.1㊀动物和分组:44只雄性特异性无病原体(SPF) C57BL/6小鼠,体重(18ʃ2)g,购自北京维通利华有限公司,常规喂养一周后进行后续实验㊂将小鼠随机分为正常对照组㊁模型组㊁美沙拉嗪组和Let-7i-5p抑制剂4组,每组11只小鼠㊂在造模成功后,美沙拉嗪组小鼠连续14d灌胃30.8g/kg美沙拉嗪(MSLZ缓释颗粒;商品号:艾迪莎)㊂Let-7i-5p抑制剂组小鼠在造模前连续5d腹腔注射20mg/kg Let-7i-5p抑制剂(MH10211,Thermo Fisher Scientific,MA,c USA)㊂每天观察小鼠的活动情况㊁毛发颜色和粪便情况㊂1.2㊀试剂和仪器:5%2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS, Sigma-Aldrich,USA);10%水合氯醛(上海生物医学实验室有限公司);无水乙醇(杭州龙山化学有限公司);中心静脉导管(上海京医疗器械有限公司);Let-7i-5p引物(上海生物医学实验室有限公司);TLR4㊁MyD88㊁TRAF-6㊁NF-κB㊁TNF-α和IL-1β引物(TaKaRa,日本);抗体β-actin和NF-κB(Cell Signa-ling Technology,美国);TLR4㊁MyD88和TRAF-6(Ab-cam,美国);二抗和电泳仪(Bio-Rad,美国);RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒(TaKaRa,日本);实时PCR 系统(Applied Biosystems,美国)㊂1.3㊀小鼠UC模型的构建:每组小鼠注射10%3mL/ kg水合氯醛进行麻醉㊂用石蜡油润滑的深静脉导管缓慢插入距肛门约8cm处的结肠㊂模型组㊁MSLZ组和Let-7i-5p抑制剂组小鼠分别采用0.02mL/kg5% TNBS+0.25mL50%乙醇进行结肠裂解㊂而对照组小鼠接受等剂量生理盐水溶解㊂溶肠结束时推0.3mL 空气,用棉签堵塞小鼠肛门㊂轻揉小鼠腹部1min后倒置5min㊂随后小鼠正常饮食㊂小鼠UC模型的成功构建的评估标准如下:模型构建后2d内,小鼠出现精神疲劳㊁毛发无光泽㊁萎蔫㊁懒惰和进食减少的症状㊂此外,小鼠腹泻和排便频率增加,肛周皮毛粘稠,粪便中有脓液和血㊂1.4㊀实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR):采用TR-Izol(Invitrogen,美国)法提取结肠组织中的总RNA㊂按照PrimeScript RT试剂盒(TaKaRa,日本)的说明进行逆转录㊂qRT-PCR严格按照SYBR Premix Ex Taq TM(TaKaRa,日本)进行㊂具体的qRT-PCR程序为:在95ħ预变性30s,然后在95ħ预变性40次循环5s,在60ħ退火和延伸30s㊂采用2-әәCt法计算其相对基因表达量㊂所用的引物序列如表1㊂表1㊀实时荧光定量PCR反应引物序列基因Gene引物序列Primer sequence(5'-3')β-actin F:GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAR:GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG Let-7i-5p F:ACACTCCAGCTGGGTGAGGTAGTAGTTTR:TGGTGTCGTGGAGTCGTLR4F:CTCACAACTTCAGTGGCTGGATTTAR:GTCTCCACAGCCACCAGATTCTC MyD88F:TATACCAACCCTTGCACCAAGTCR:TCAGGCTCCAAGTCAGCTCATC TRAF-6F:TTTGGCGTCGGAGACACTTGR:TTTGGCGTCGGAGACACTTGNF-ΚB F:CATGCGTTTCCGTTACAAGTGR:GTGCGTCTTAGTGGTATCTGTGCT TNF-αF:TCAGTTCCATGGCCCAGACR:GTTGTCTTTGAGATCCATGCCATTIL-1βF:CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCAR:CCCAAGTCAAGGGCTTGGAA1.5㊀蛋白质印迹法:裂解结肠组织以获取总蛋白,然后测定总蛋白浓度㊂等量的蛋白质样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,Billeri-ca,美国)㊂用脱脂牛奶封闭后,将PVDF膜与一抗(Cell Signaling Technology,美国)在4ħ下孵育过夜㊂第2天,将PVDF膜与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗在室温下孵育2~3h㊂最后,使用增强化学发光(ECL)试剂(Thermo Fisher Scientific,美国)观察蛋白㊃155㊃质条带㊂利用Image J 软件进行定量光密度分析㊂1.6㊀免疫组化:采用免疫组化法检测结肠组织中TLR4和NF -κB 在结肠组织中的表达情况㊂结肠组织用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片厚度4μm 进行免疫组化染色㊂在二甲苯孵育和乙醇浓度下降后,用柠檬酸缓冲液在100ħ下提取抗原15min ㊂内源性过氧化物酶在室温下通过3%过氧化氢去除,然后在37ħ下用5%山羊血清阻断㊂随后,切片与兔抗鼠或抗人TLR4和NF -κB (Santa Cruz Biotechnology ,Santa Cruz ,美国)一抗在最佳浓度下孵育过夜,然后在37ħ下与HRP 偶联的二抗孵育㊂最后,切片使用苏木精染色并在上升浓度的乙醇中脱水,在二甲苯中清除㊂使用显微镜((Olympus Corporation ,日本)采集图像㊂1.7㊀ELISA 检测小鼠血清中IL -1β和TNF -α的水平:每组小鼠眼眶取血,室温放置2h 后离心收集血清㊂IL -1β和TNF -α的含量按照ELISA (Thermo FisherScientific ,美国)试剂盒中的操作说明书进行测定㊂1.8㊀统计分析:采用Graphpad prsim8.0软件进行统计处理及作图,数据在进行正态性检验后以均数ʃ标准差( xʃs)表示,组间比较采用T 检验㊂P <0.05认为差异具有统计学意义㊂2㊀结㊀果2.1㊀美沙拉嗪抑制溃疡性结肠炎小鼠Lei -7i -5p 的表达:qRT -PCR 结果显示,模型组小鼠结肠组织中和血清中Lei -7i -5p 的表达明显高于对照组(P <0.001),表明溃疡性结肠炎导致Lei -7i -5p 的上调㊂而MSLZ 或Lei -7i -5抑制剂处理后,与模型组相比,Lei -7i -5p 的表达明显受到抑制(P <0.001,图1A -B ),这说明美沙拉嗪可能通过调控Lei -7i -5p 的表达治疗溃疡性结肠炎㊂图1㊀美沙拉嗪抑制溃疡性结肠炎小鼠Lei -7i -5p 的表达(n =11)A ㊁qRT -PCR 检测小鼠结肠组织中Lei -7i -5p 的表达量㊂B ㊁qRT -PCR 检测小鼠血清中Lei -7i -5p 的表达量㊂与模型组相比,∗∗∗∗P<0.00012.2㊀美沙拉嗪通过调控Lei -7i -5p 的表达改善小鼠溃疡性结肠炎的症状:溃疡性结肠炎小鼠体重随着时间的增加显著下降,但经MSLZ 和Lei -7i -5抑制剂治疗后体重下降减慢,体重显著高于模型组(P <0.0001和P<0.001)(图2A )㊂从疾病活跃指数(DAI )评分可以看出MSLZ 和Lei -7i -5抑制剂组显著的改善了小鼠溃疡性结肠炎,与模型组相比DAI 评分显著下降(P<0.0001)(图2B )㊂根据小鼠结肠HE 染色结果,模型组小鼠粘膜上皮损伤和腺体变形,组织学损伤评分高于正常对照组(P <0.0001)㊂MSLZ 组和Lei -7i -5抑制剂组粘膜上皮组织完整,腺体排列有序,组织学损伤评分均低于模型组(P <0.0001)(图2C -D )㊂以上结果说明抑制Lei -7i -5p 的表达改善小鼠溃疡性结肠炎的症状㊂图2㊀美沙拉嗪通过调控Lei -7i -5p 的表达改善小鼠溃疡性结肠炎的症状(n =11)A ㊁小鼠体重变化㊂B ㊁疾病活跃指数评分㊂C ㊁小鼠结肠组织HE 染色㊂D ㊁小鼠结肠组织的组织学损伤评分㊂与模型组相比,∗∗∗P<0.001,∗∗∗∗P<0.0001㊃255㊃2.3㊀美沙拉嗪通过Lei-7i-5调控溃疡性结肠炎小鼠中TLR4/MyD88依赖通路中相关基因的表达:为了探究Let-7i-5p在美沙拉嗪治疗小鼠溃疡性结肠炎中的作用机制,通过qRT-PCR检测了小鼠结肠组织中TLR4㊁MyD88㊁TRAF-6和NF-κB的mRNA表达水平㊂结果表明,模型组的TLR4㊁MyD88㊁TRAF-6和NF-kB的mRNA表达水平均高于对照组(P<0.0001);MSLZ组和Lei-7i-5抑制剂治疗后TLR4㊁MyD88㊁TRAF-6和NF-κB的mRNA表达水平显著低于模型组(P<0.0001),但仍高于正常对照组(图3A-D)㊂此外,通过Western blot检测了各组结肠组织中TLR4㊁MyD88㊁TRAF-6和NF-κB蛋白水平㊂与对照组相比,模型组中上述基因的蛋白表达水平显著升高(P<0.01),MSLZ和Lei-7i-5抑制剂治疗后各蛋白水平的表达显著低于模型组(P<0.01)(图3E-F),但仍高于正常对照组㊂最后,通过免疫组化检测了小鼠结肠组织中TLR4和NF-κB的蛋白表达水平㊂模型组中TLR4和NF-κB的表达显著高于正常对照组,MSLZ组和Lei-7i-5抑制剂治疗后TLR4和NF-κB的表达显著低于模型组,但仍高于正常对照组,且MSLZ组对以上两种蛋白的抑制效果高于Lei-7i-5抑制剂组(图3G-H)㊂以上结果说明美沙拉嗪通过Lei-7i-5调控溃疡性结肠炎小鼠中TLR4/MyD88依赖通路中相关基因的表达㊂图3㊀美沙拉嗪通过Lei-7i-5调控溃疡性结肠炎小鼠中TLR4和MyD88的表达(n=11)A-D㊁qRT-PCR检测各组小鼠结肠组织中TLR4㊁MyD88㊁TRAF-6和NF-κB的mRNA表达水平㊂E-F㊁Western blot检测各组小鼠结肠组织中TLR4㊁MyD88㊁TRAF-6和NF-κB的蛋白表达水平㊂G-H㊁免疫组化染色检测各组小鼠结肠组织中TLR4和NF-κB的蛋白表达水平㊂与模型组相比,∗P<0.05,∗∗P<0.01,∗∗∗P<0.001,∗∗∗∗P<0.00012.4㊀美沙拉嗪抑制了溃疡性结肠炎小鼠中炎症因子的表达:通过qRT-PCR检测了小鼠结肠组织中TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平㊂结果表明,模型组的TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平均高于对照组(P<0.0001),MSLZ组和Lei-7i-5抑制剂治疗后TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平显著低于模型组(P<0.0001),但仍高于正常对照组(图4A-B)㊂进一步的又检测了小鼠血清中TNF-α和IL-1β的表达水平,也得到了同样的结果,模型组的TNF-α和IL-1β的表达水平均高于对照组(P<0.0001),而MSLZ组和Lei-7i-5抑制剂治疗后这两种蛋白的表达量相比于模型组显著下降(P<0.0001)(图4C-D)㊂㊃355㊃图4㊀美沙拉嗪抑制了溃疡性结肠炎小鼠中炎症因子的表达(n =11)A -B ㊁qRT -PCR 检测各组小鼠结肠组织中TNF -α和IL -1β的mRNA 表达水平㊂C -D ㊁ELISA 检测各组小鼠血清中TNF-α和IL -1β的表达水平㊂与模型组相比,∗∗∗∗P<0.00013㊀讨㊀论UC 是一种慢性复发性或持续性结肠炎症性疾病,其典型发病特征包括腹痛㊁腹泻和便血[1]㊂随着人类生活节奏的加快和生活方式的改善,UC 的发病率在中国不断上升㊂但其具体发病机制尚不清楚,研究表明UC 与遗传㊁饮食和环境因素㊁肠道菌群紊乱和免疫屏障相关[8]㊂美沙拉嗪常用于UC 的治疗,但其确切的治疗机制还需进一步的研究㊂Toll 受体是一种模式识别受体,TLR4介导先天防御反应,主要识别细菌脂多糖,被刺激后激活MyD88因子和下游转录因子NF -κB ,进一步刺激炎症因子的释放和分泌[6]㊂有研究表明UC 小鼠MyD88蛋白的表达水平与炎症程度呈正相关[9],提示调节TLR4/MyD88/NF -κB 信号通路在UC 的发生和发展中起着至关重要的作用㊂因此,开发能够靶向和调控TLR4/MyD88/NF -κB 信号通路的药物是一个迫切有待解决的问题㊂近年来,miRNAs 已成为医学领域的研究热点,随着对基因组的深入研究,人们发现非编码RNA 也会影响编码蛋白的合成㊂最初的miRNAs 在细胞核中被Drosha 酶裂解成前体miRNAs ,后者通过将蛋白质从细胞核运输到细胞质而转移㊂它们被Dicer 酶切割成具有20-25个核苷酸大小的miRNAs ㊂成熟的miRNAs 可以结合到3'非翻译区位点,从而调控基因编码㊂这引起了学者们的关注,越来越多的研究证实了miRNA 在UC 患者的血清㊁结肠组织和粪便中的异常表达㊂我们认为这些异常表达的miRNAs 可导致UC 的发生发展或加重疾病㊂在对19例UC 患者进行研究时,Lin 等通过miRNAs 筛选发现,miR -147b ㊁miR -194-2㊁miR -383㊁miR -615㊁miR -1826与正常人相比表达存在差异,其调控机制可能与TGF -β㊁STAT3㊁IL -8和PI3K /AKT /mTOR 信号通路有关㊂通过基因治疗靶向调控差异表达miRNAs 的研究将为UC 提供新的研究思路和治疗方案㊂本研究采用TNBS /乙醇诱导的小鼠UC 模型进行实验㊂该体内模型与人类UC 相似,具有病程长㊁操作简单㊁成本效益高㊁实用性强㊁重复性好等优点㊂模型组小鼠血清和结肠组织中Let -7i -5p 高表达,且结肠组织病理损伤较对照组更严重,表现有结肠粘连㊁稀便㊁便血等症状㊂而美沙拉嗪和Let -7i -5p 抑制剂治疗后大鼠结肠粘附和出血均有改善㊂为进一步研究美沙拉嗪通过Let -7i -5p 对UC 小鼠的调控作用,我们检测了TRL4㊁MyD88㊁TRAF -6和NF -κB 的表达水平,以了解UC 小鼠中TLR4/MyD88通路的变化㊂此外,我们还测定了IL -1β和TNF -α的水平,以阐明TLR4/MyD88通路对UC 诱导的炎症反应的调控作用㊂Western blot 和qRT -PCR 结果显示,模型组小鼠中TRL4㊁MyD88㊁TRAF -6和NF -κB 的mRNA 和蛋白水平均显著高于对照组㊂这提示了TLR4/MyD88依赖通路在UC 中的特定作用㊂此外,MSLZ 和Let -7i -5p 抑制剂处理后下调了这些基因的表达,特别是在蛋白水平上㊂模型组的炎症因子IL -1β和TNF -α的mR-NA 和蛋白水平均显著高于正常对照组㊂MSLZ 和Let -7i -5p 抑制剂处理均能抑制其在UC 小鼠中的表达水平㊂MSLZ 对UC 小鼠的治疗效果与Let -7i -5p 抑制剂不完全一致,说明MSLZ 通过Let -7i -5p /TLR4/MyD88信号通路治疗UC 的这一机制,与之前报道的MSLZ 治疗UC 的机制可能存在部分交际㊂Let -7i -5p /TLR4/MyD88信号通路是否能够调控前列腺素和㊃455㊃白三烯的合成,以及对氧自由基和肠黏膜内脂肪酸的调控需要进一步的研究㊂总之,我们的研究结果表明,在TNBS /乙醇诱导的UC 小鼠模型中,MSLZ 可以抑制小鼠血清和结肠组织中Let -7i -5p 的表达㊂此外,MSLZ 通过抑制UC 小鼠的TLR4/MyD88依赖通路来抑制炎症因子的释放㊂ʌ参考文献ɔ[1]㊀CLE Berre ,S Honap ,L Oeyrin -biroulet.Ulcerative colitis[J ].Lancet ,2023,402(10401):571-584.[2]㊀M Naganuma ,S Mizuno ,K Nanki ,et al.Recent trends andfuture directions for the medical treatment of ulcerative [J ].Clin Gastroenterol ,2016,9(6):329-336.[3]㊀PM Veoso ,R Machado ,C Nobre.Mesalazine and inflammato-ry bowel disease -from well -established therapies to progress beyond the state of the art [J ].Eur Pharm Biopharm ,2021(167):89-103.[4]㊀OH Nielsen ,LK Munck.Drug insight :aminosalicylates forthe treatment of IBD [J ].Nat Clin Pract Gastroenterol Hep-atol ,2007,4(3):160-170.[5]㊀C LE Berre ,G Roda ,M Nedeljkovic Protic ,et al.Modern useof 5-aminosalicylic acid compounds for ulcerative colitis[J ].Expert Opin Biol Ther ,2020,20(4):363-378.[6]㊀Q Wang ,Y Hou ,D Yi ,et al.Protective effects of N -acetyl-cysteine on acetic acid -induced colitis in a porcine model [J ].BMC Gastroenterol ,2013,13(133):133.[7]㊀JM Gonzalez -navajas ,S Fine ,J Law ,et al.TLR4signaling ineffector CD4+T cells regulates TCR activation and experi-mental colitis in mice [J ].Clin Invest ,2010,120(2):570-581.[8]㊀RA Gupta ,MN Motiwala ,NG Dumore ,et al.Effect of piper-ine on inhibition of FFA induced TLR4mediated inflamma-tion and amelioration of acetic acid induced ulcerative colitisin mice [J ].Ethnopharmacol ,2015,164:239-246.[9]㊀M Chamanara ,A Rashidian ,SE Mehr ,et al.Melatonin amel-iorates TNBS -induced colitis in rats through the melatonin receptors :involvement of TLR4/MyD88/NF -κB signalling pathway [J ].Inflammopharmacology ,2019,27(2):361-371.ʌ文章编号ɔ1006-6233(2024)04-0555-06PKGIα通路抑制剂DT -3对胃癌细胞增殖和迁移的影响张秀芬1,㊀潘理会2,㊀李春辉1(1.承德医学院附属医院病理科,㊀河北㊀承德㊀0670002.承德医学院,㊀河北㊀承德㊀067000)ʌ摘㊀要ɔ目的:探讨PKGIα信号通路特异性抑制剂DT -3对胃癌细胞增殖和迁移的影响㊂方法:利用生物信息学分析,基于GEO ㊁TCGA ㊁HPA ㊁Kaplan -Meier plotter 数据库和GEPIA 在线分析网站对PKGI 在组织中的表达进行差异分析并探讨PKGI 和PKGIα在胃癌患者中的预后情况㊂采用CCK -8㊁克隆形成实验检测DT -3对细胞增殖的影响,划痕愈合实验观察DT -3对细胞迁移的影响;Western blot-ting 法验证PKGIα的蛋白表达和相关性分析㊂结果:胃腺癌组织中PKGI mRNA 表达增高,在42种胃癌细胞株里有27种能检测到PKGI mRNA 的表达,高表达PKGIαmRNA 的胃癌组织更具肿瘤侵袭性;免疫组织化学(IHC )结果展示PKGI 蛋白表达情况,12例胃癌组织中观察到6例存在中㊁高强度的细胞质染色阳性反应;PKGI 和CDH1的表达呈负相关(r =-0.74,P <0.05);生存分析显示PKGI 和PKGIαmRNA 高表达对胃腺癌患者的总生存期(OS )有统计学意义(HR>1,logrank P <0.05)㊂实验结果表明PKGIα蛋白在人胃癌细胞株AGS 中的表达增加;DT -3抑制细胞增殖迁移(P <0.05),使NF -κB 磷酸化p65表达降低,且PKGI 和NF -κB p -p65的表达呈极强正相关(r =0.957,P <0.05)㊂结论:通过抑制PKGIα信号通路,可以有效抑制胃癌细胞增殖迁移㊂ʌ关键词ɔ㊀PKGIα通路;㊀DT -3;㊀NF -κB p -p65;㊀生物信息学分析;㊀胃癌细胞AGS ʌ文献标识码ɔ㊀A㊀㊀㊀㊀㊀ʌdoi ɔ10.3969/j.issn.1006-6233.2024.04.05Signaling Pathway by DT -3a Inhibitor of the PKGIαPathway on Proliferationand Migration of Gastric Cancer Cells㊃555㊃ʌ基金项目ɔ2022年承德市科技计划自筹经费项目(第三批),(编号:202204A027)ʌ通讯作者ɔ李春辉。
小鼠溃疡性结肠炎模型的建立与评价
小鼠溃疡性结肠炎模型的建立与评价曹明泽;王旭荣;王磊;张景艳;王海瑞;李建喜;王学智【摘要】本试验旨在通过筛选葡聚糖硫酸钠盐(DSS)最佳浓度建立小鼠溃疡性结肠炎模型.将30只BALB/c小鼠随机分为对照组、3.5％DSS组、5％DSS组,每组10只.小鼠自由饮水5d,每天记录小鼠体重,观察粪便性状,测便潜血.试验结束后测血清TNF-α、结肠组织髓过氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)、还原性谷胱甘肽(GSH)活性变化等指标,计算结肠重量/长度比值.与对照组相比,两试验组结肠组织中MPO 活性显著升高(P＜0.05),MDA含量显著升高(P＜0.05),GSH含量显著降低(P＜0.05).结果表明,两种浓度葡聚糖硫酸钠盐均可造模成功,5％ DSS组小鼠精神状态很差,表现嗜睡、萎靡状态,而3.5％DSS组小鼠精神状态良好,且组织中MPO、MDA、GSH与对照组相比均差异显著(P＜0.05),与5％ DSS组相比差异不显著(P ＞0.05),因此,选用浓度为3.5％ DSS造模更合适.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)001【总页数】5页(P171-175)【关键词】溃疡性结肠炎;疾病活动指数;TNF-α;髓过氧化物酶;丙二醛;还原型谷胱甘肽【作者】曹明泽;王旭荣;王磊;张景艳;王海瑞;李建喜;王学智【作者单位】中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业部兽用药物创制重点实验室,甘肃省新兽药工程重点实验室,兰州730050【正文语种】中文【中图分类】R574.62炎症性肠病(IBD)是一种慢性、复发性、非特异性肠道炎症疾病，包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)两个独立的疾病，二者在临床表现和病理特点上各不相同。
溃疡性结肠炎(脾肾阳虚证)大鼠模型的实验研究
溃疡性结肠炎(脾肾阳虚证)大鼠模型的实验研究王燚霈;朱莹;王璇【摘要】目的研制与临床证候相吻合的切实可行的溃疡性结肠炎(脾肾阳虚证)的大鼠模型.方法将SD实验大鼠按随机数字表法随机分为4组:正常对照组、脾肾阳虚组、溃疡性结肠炎组(溃结组)、脾肾阳虚溃结组(病证结合组),正常对照组无任何干预措施;脾肾阳虚组先以番泻叶灌胃,然后用冰水湿润皮毛后再用电风扇将其皮毛吹干;溃结组以三硝基苯磺酸钠(TNBS)灌肠;病证结合组先以脾肾阳虚组的方法处理,连续处理4周后,再予TNBS灌肠.观察大鼠一般症状体征、中医证候、结肠组织的改变、血清大鼠游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、大鼠游离四碘甲状腺原氨酸(FT4)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)等指标.结果病证结合组、脾肾阳虚组大鼠的中医证候评分、血清FT3、FT4、SOD、MDA等指标与正常对照组、溃结组相比,差异有统计学意义(P＜0.05);病证结合组、溃结组结肠肉眼观及结肠黏膜损伤程度与正常对照组、脾肾阳虚组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论先以番泻叶灌胃及冰水湿身风干法处理大鼠,再用TNBS灌肠,从而研制出的溃疡性结肠炎(脾肾阳虚证)大鼠模型,对临床有实践意义.【期刊名称】《中国中医急症》【年(卷),期】2015(024)008【总页数】4页(P1332-1334,1391)【关键词】溃疡性结肠炎;脾肾阳虚证;病证结合;动物模型;大鼠【作者】王燚霈;朱莹;王璇【作者单位】湖南中医药大学第二附属医院,湖南长沙410005;湖南中医药大学第二附属医院,湖南长沙410005;湖南中医药大学第二附属医院,湖南长沙410005【正文语种】中文【中图分类】R285.5溃疡性结肠炎（UC）的病因尚不十分清楚，在我国发病率逐年增高［1］。
为了更好地阐明该病的病因病机、发展规律及理想的防治，建立理想的动物模型具有重要的意义。
笔者在近10年的临床研究中发现，大多UC患者临床表现以脾肾阳虚的症状为主，目前临床上对于溃疡性结肠炎动物模型的研究多种多样，但未见有契合脾肾阳虚证的动物模型。
结肠炎模型建立及评价
溃疡性结肠炎动物模型建立、评价溃疡性结肠炎( Ulcerative Colitis) 又称非特异性溃疡性结肠炎,是一种病因不明的大肠黏膜的慢性炎症和溃疡性病变。
主要临床表现有腹痛，腹泻、粘液脓血便、里急后重等。
病程长，常反复发作，迁延不愈，发作期与缓解期交替，较难治愈。
病变主要累及直肠和乙状结肠，严重者可侵犯全部结肠甚至回肠末端，其病理特点是结肠黏膜广泛溃疡形成。
溃疡性结肠炎发病可能与感染、遗传及免疫等因素有关。
[1]建立理想的动物模型对于阐明该病的病因、病变发展规律以及有效的防治有重要意义。
利用动物模型实验，可以免去对人体的伤害；可以严格控制条件，排除各种干扰；提高复制的成功率和缩短病程，便于实验的多次重复；便于实验样品的全面采集。
动物模型固然有其优越性，可是毕竟这是一种带有模拟性质的间接实验，得出的结论具有局限性。
关键词：溃疡性结肠炎；动物模型；病理动物模型具有UC动物模型的制备方法, 大致可分为四类：免疫诱发法，化学损伤法，复合法，中医证型造模法。
1.免疫造模法张晓峰等[2]取家免或人新鲜结肠黏膜组织，加入完全弗氏佐剂，制成抗原乳剂，首次于大鼠足跖注射抗原乳剂0.4ml（含抗原4mg），第10、17、24、31天时分别于大鼠不同部位皮下注射抗原乳剂0.8ml（含抗原8mg），第31天不加佐剂灌肠。
予抗原4mg。
上述处理结束后第2天, 大鼠出现黏液血便, 精神萎靡。
病变黏膜可见炎症、溃疡形成, 促炎细胞因子IL- l、IL- 6、TNF及其mRNA 表达增强, 免疫球蛋白也发生与人UC相似的变化[3]。
该模型的特点是病变持续时间较长，与人UC的免疫发病机制和病理变化均较接近, 但造模过程较繁琐, 周期较长，掌握困难，重复性不理想。
黄永年等[4]取牛结肠黏膜蛋白与完全弗氏佐剂( 1: 1)制成完全抗原，大鼠首次足跖内注射抗原4mg/只,于第10、17、24、31天分别于足跖、背部、腹股沟、腹腔内注射抗原6mg/只，最后1次注射不加佐，至血清抗结肠抗体达到作用有效量、第35天用20g/L的甲醛溶液1.5 ml灌肠, 留置1用生理盐水洗净后排去，再用抗原液( 4 g /L,不加佐剂)2 ml灌肠，置2 h, 3d 后处死大鼠, 取其结肠标本，病理检查有充血、水肿、炎细胞浸润和溃疡形成等。
溃疡性结肠炎模型选择及评价指标
溃疡性结肠炎模型采用及评介指标之阳早格格创做1，真验候选模型：葡散糖硫酸钠（DSS）致动物溃疡性结肠炎模型.DSS UC模型的特性: ①采与自由饮用大概者定量灌胃DSS溶液的要领修坐模型，真验条件战收配要领简朴，益伤易复制，便于掌握战推广；②可通过改变DSS溶液的浓度战效率时间修坐慢性、缓性战慢缓性接替性模型，模型持绝时间少，体现了慢性背缓性转移的动背历程，办理了UC的缓性化战保护问题，那是往日许多模型无法比较的；③已证据DSS模型是由1型/2型辅帮性T细胞( Th1/ Th2) 型细胞反应介导的，其收病与TNF-α、IFN-γ战IL-10等有闭，那与人类UC 的免疫教反应很相似；④分歧种系动物对于DSS 的敏感性分歧，为掀穿遗传果素与UC的闭系提供了新的依据；⑤DSS UC模型的构制教特性战临床表示与人类UC极为相似，如病变从肛门侧自下而上连绝性死少，慢性期可睹黏膜充血火肿、集正在溃疡战中性粒细胞浸润，缓性期可睹腺体萎缩、结肠收缩战巨噬细胞浸润，临床表示主要为背泻、体沉减少、血便等.2，真验候选动物：C3H/HeJ Bir小鼠大概者BALB/c小鼠动物种系: DSS UC模型适用于多种动物，包罗百般大鼠、小鼠、仓鼠战豚鼠等，但是百般系对于DSS的易感性战病变部位存留好别，其中大鼠、小鼠的病变主要以曲肠战左半结肠为主，而仓鼠、豚鼠则以盲肠战左半结肠较为明隐.Mahler等将3.5% DSS(分子量为Mr 36000～46000) 溶于饮用火，予9只分歧种系的小鼠饮用以诱导UC，截止临床战构制病理教表示各没有相共，C3H/HeJ Bir小鼠对于DSS最敏感，病变主要位于近端结肠战回盲部； C57BL/6J小鼠的中段战近端结肠易爆收炎症；大部分NON/LtJ小鼠对于DSS 没有敏感；BALB/c小鼠对于DSS 敏感，病变主要位于结肠近端.溃疡性结肠炎是一种限制于结肠粘膜及粘膜下层的炎症历程.病变多位于乙状结肠战曲肠，C3H/HeJ Bir小鼠战BALB/c小鼠对于DSS致溃疡性结肠炎敏感，且病灶部位与人类相似（乙状结肠战曲肠），果此可动做真验钻研理念动物.3，D SS分子量及浓度：Mr=40000，浓度=3%-5% 1%～10%DSS浓度可用于UC 模型.DSS诱导肠黏膜慢性益伤的程度呈浓度依好性，已正在BALB/c小鼠中得到了证据.Granger等钻研了DSS摄与量的估计公式，DSS用量(mg/g) =总饮火量(ml)×[DSS (mg)/100 ml]/小鼠初初体沉( g)，指出诱导稳当战沉复性佳的UC模型[以构制髓过氧化物酶(MPO) 的活性战构制病理变更为尺度)，DSS总摄与量的最矮阈值为30mg/g体沉，只消DSS的背荷量达到30mg/g那一闭键剂量，其总摄进量的好别没有会效率炎症反应的宽沉程度.DSS 浓度是制摸乐成的最闭键果素，可效率制模时间战临床表示.据报导，小鼠饮用含1% DSS溶液90天后，仅出现大便隐血考查阳性.Egger等应用分歧浓度的DSS( 0%、2.5%、5%、7.5%) 溶液喂养BALB/c小鼠7天，截止创制结肠腺体益伤评分随DSS浓度的普及呈线形减少，但是与DSS 总摄与量无相闭性，由此估计DSS诱导黏膜益伤的程度依好于DSS 浓度，而非总摄与量.但是DSS浓度过下，动物牺牲率也会降下.予无胸腺小鼠饮用含5% DSS溶液，与饮用1.5%、2.5% DSS 溶液( 各浓度的分子量相共)组比较，其致死率明隐降下.暂时，真验中中最常采与3%大概5%的DSS溶液举止制模.4．评介指标4.1 徐病活动度用大便情况动做徐病活动度（DAI）评介，评介细则如下睹表-1.表-1 DAI评分细则评分大便性状隐血大概血便0平常阳性1硬便阳性2硬便隐血阳性3背泻隐血阳性4背泻血便4.2 结肠病灶病理构制隐微镜查看并评分（CMDI），评分尺度如下：溃疡：分三级，0—无，1—小溃疡（小于3mm），2—大溃疡（大于3mm）炎症：0—无，1—沉度，2—沉度肉芽构制：0—无，1—有病变深度：0—无，1—粘膜下层，2—肌层，3—浆膜层纤维化：0—无，1—沉度，2—沉度4.3 对于免疫器官的效率：1）免疫器官净器系数①脾净，②胸腺；2）4.4 免疫指标 1）抗人中性粒细胞胞量抗体（P-ANCA）：蛋黑火解酶（PR3）、构制蛋黑酶G（CG）.2）抗结肠抗体（ACA），3）免疫球蛋黑IgA战IgG，局部免疫反应已证据结肠粘膜爆收洪量IgA战IgG，焦君良等以人体结肠粘膜为抗本，用之攻打大鼠后，大鼠结肠粘膜出现典型溃疡，病变部位洪量淋巴、单核战嗜中性细胞浸润，局部制型动物血浑抗大肠抗体阳性，免疫球蛋黑IgA 战IgG明隐删下，淋巴细胞转移率隐著落矮.以上截止均收援溃疡性结肠炎的自己免疫收病教道. 4）细胞免疫指标：CD4、CD8、T淋巴细胞战可溶性黑细胞介素2受体（SIL-2R）动做细胞免疫的主要指标被认为与溃疡性结肠炎的宽沉程度有闭5）炎症细胞果子：TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-4、IL-104.5 其余死化指标：MPO，SOD，MDA。
消化系统疾病动物模型
消化系统疾病动物模型（一）胃肠疾病动物模型1、急性胃炎动物模型（1）酸制剂诱发急性胃炎模型：Wistar大鼠，雄性，300g，大鼠禁食24h，在清醒状态下，用下述试剂或物质灌胃：①水杨酸制剂（如20mmol／L阿司匹林或水杨酸溶液）按100mg／kg体重灌胃；②2ml10mmol／L的醋酸或2ml不同浓度的盐酸（1、10、100mmol／L）；③2ml同种动物胆汁或2mmol／L的牛磺胆酸；④2ml15％的乙醇。
4h 后处死动物，剖检可见胃内发生急性弥漫性炎症改变。
胃粘膜表面有浅表糜烂、出血，粘膜层内见中性粒细胞浸润。
（2）胆汁反流性胃炎模型：碱性肠液倒流入胃，刺激胃粘膜可引起炎症，即胆汁反流性胃炎。
常见于原发性或继发性幽门功能紊乱或胃切除手术后。
本法取上部小肠的碱性肠液注入已结扎幽门的同种大鼠胃内，使之对胃粘膜产生持续刺激，形成胃炎。
动物选取雄性Wistar大鼠，体重180～220g,制备上部小肠液，向胃内注入小肠液，2 ml/只（正常对照组注入2 ml生理盐水）。
缝合腹壁，腹腔注射阿托品5 mg/kg体重，以抑制胃液分泌，利于胃粘膜损伤模型的形成。
处死大鼠，开腹，结扎贲门，取出胃，沿胃大弯剪开。
用滤纸吸干表面水分，立即称量胃重，以胃湿重/体重之比（胃系数）表示胃水肿程度。
肉眼观察并计数整个胃粘膜出血点数，作为损伤指数。
模型组动物胃系数和损伤指数明显增加，肉眼观察模型组胃粘膜充血、水肿，皱襞减少，颜色暗红，并有大量散在出血点。
2、慢性胃炎动物模型（1）大鼠慢性萎缩性胃炎模型酗酒、用药不当、饮食习惯不良、幽门螺杆菌感染、自身免疫等是此病的主要病因。
组织病理学是评价造模成功的最主要指标，主要观察和测量胃粘膜厚度、粘膜肌层厚度、腺体数量、壁细胞数量、固有层炎细胞浸润程度和肠化生发生率等。
综合法一：胆汁（去氧胆酸钠）+热水+主动免疫综合法二：去氧胆酸钠+热糊+主动免疫综合法三：去氧胆酸钠+酒精+氨水+吲哚美锌3、动物胃粘膜肠上皮化生模型（1）X线胃局部照射诱发胃粘膜肠化生模型：选用5～8周龄的Wistar 或JCL/SD大鼠。
溃疡性结肠炎模型选择及评价指标
溃疡性结肠炎模型选择及评价指标1，实验候选模型：葡聚糖硫酸钠（DSS）致动物溃疡性结肠炎模型.DSS UC模型的特点：①采用自由饮用或者定量灌胃DSS溶液的方法建立模型, 实验条件和操作方法简单, 损伤易复制，便于掌握和推广；②可通过改变DSS溶液的浓度和作用时间建立急性、慢性和急慢性交替性模型，模型持续时间长，体现了急性向慢性转化的动态过程，解决了UC的慢性化和维持问题，这是以前许多模型无法比拟的；③已证实DSS模型是由1型/2型辅助性T细胞( Th1/ Th2) 型细胞反应介导的，其发病与TNF—α、IFN—γ和IL—10等有关,这与人类UC 的免疫学反应很相似；④不同种系动物对DSS的敏感性不同，为揭示遗传因素与UC 的关系提供了新的依据；⑤DSS UC模型的组织学特点和临床表现与人类UC极为相似，如病变从肛门侧自下而上连续性发展，急性期可见黏膜充血水肿、散在溃疡和中性粒细胞浸润,慢性期可见腺体萎缩、结肠缩短和巨噬细胞浸润，临床表现主要为腹泻、体重减轻、血便等。
2，实验候选动物：C3H/HeJ Bir小鼠或者BALB/c小鼠动物种系：DSS UC模型适用于多种动物，包括各种大鼠、小鼠、仓鼠和豚鼠等, 但各种系对DSS的易感性和病变部位存在差异，其中大鼠、小鼠的病变主要以直肠和左半结肠为主，而仓鼠、豚鼠则以盲肠和右半结肠较为明显。
Mahler 等将3。
5% DSS（分子量为Mr 36000～46000) 溶于饮用水，予9只不同种系的小鼠饮用以诱导UC,结果临床和组织病理学表现各不相同,C3H/HeJ Bir小鼠对DSS最敏感,病变主要位于远端结肠和回盲部；C57BL/6J小鼠的中段和远端结肠易发生炎症；大部分NON/LtJ小鼠对DSS不敏感；BALB/c小鼠对DSS 敏感,病变主要位于结肠远端。
溃疡性结肠炎是一种局限于结肠粘膜及粘膜下层的炎症过程。
病变多位于乙状结肠和直肠,C3H/HeJ Bir小鼠和BALB/c小鼠对DSS致溃疡性结肠炎敏感,且病灶部位与人类相似（乙状结肠和直肠），因此可作为实验研究理想动物。
溃疡性结肠炎动物模型的进展
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1 化学法诱导的 UC 模型
1.1 乙酸诱导的 UC 模型 乙酸能增加血管通透性 ， 激活激肽 ， 促进纤维蛋白水解 ，
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免疫应激溃疡性结肠炎模型的建立与评价参考模板
免疫应激溃疡性结肠炎模型的建立与评价作者：李楠王雪明稽杨张林张虹宋晶莹石玉玲【摘要】目的探讨用联合免疫噪声应激法建立大鼠溃疡性结肠炎模型的可行性及价值。
方法将80只Wister大鼠随机分为A、B、C、D四组，每组20只。
A组为正常对照组；B组为免疫造模组；C组为噪声应激组；D组为免疫+噪声应激联合组。
比较造模后20 d 各组血清皮质醇、结肠组织中MPO、NO水平和结肠组织损伤评分。
结果联合免疫噪声应激法较免疫组、噪声应激组的结肠组织损伤评分、血清皮质醇、结肠组织MPO、NO含量均明显增高。
结论联合免疫噪声应激法建立的溃疡性结肠炎模型持续时间长，优于单一因素，是一种有价值的可行造模方法。
【关键词】免疫复合法；溃疡性结肠炎；模型；噪声：激素Foundation and Appreciation of Ulcerative Colonitis Model by Combining Immunizatione with StressAbstract： Objective To found and appreciate ulcerative colonitis model by combining immunization with stress. Methods A total of 80 Wister rats were divided into four groups (20 ratsper group), i.e. Group A (normal control group), Group B (immunization model group), Group C (noise stress model group) and Group D (immunization plus noise stress model group). Results Tissue lesion score, serum cortisol, tissue myeloperoxidase (MPO) and NO were obviously higher in Group D than in Group B or C.Conclusion The ulcerative colonitis model founded by combining immunization with stress is feasible and better than any of other models.Key words： ulcerative colonitis; model; immunization; noise; stress溃疡性结肠炎（UC）素来以病因复杂、治疗难度大、复发率高为特点，且发病率有逐年升高的趋势，已成为临床治疗的一大难题［1］。