酶法合成阿莫西林原理

酶法合成阿莫西林介绍

β-内酰胺抗生素经过多年的发展，己成为抗生素中的最主要类型之一。由于具有良好的抗菌效力，较低的毒副作用，在临床上广泛应用，其发展非常迅速。现全世界耗用量已过万吨，预计今后还会增长。其中，青霉素和头孢菌素为最重要的两大类β-内酰胺抗生素。酶法合成技术始于20世纪60年代末70年代初，经过30多年的发展，现在酶缩合反应技术、产品分离以及固定化酶技术等方面取得很大的发展，配套技术日益完善，具备了大规模工业化生产的条件。全球著名的β-内酰胺抗生素生产厂家如荷兰DSM公司已有酶法合成的商品头孢氨苄、阿莫西林等产品面世。由于酶法应用于β-内酰胺抗生素合成，不仅可减少反应步骤，而且还可减少废弃物的产生，有利于保护环境，降低生产成本，产品质量优异，所含杂质极少。因此，21世纪β-内酰胺抗生素的酶法合成将是发展的必然趋势。我国酶法合成研究起步并不晚，但至今仍未形成大规模工业化生产，与国外先进厂家差距较大。随着我国经济快速发展，人们对自身居住环境的要求，政府对环保的重视，政府和越来越多的企业加大“绿色化学制药”的研究开发，特别是加快工业化生产的推进进程。

酶法产品主要有三大特点：

一是产品含量稳定、变化小，可降低制剂在有效期内的检测风险，并且杂质低，降解速度慢，对制剂的安全性，尤其是特殊制剂的稳定性尤为重要。

二是酶法产品生产批量能够达到化学法产品的2～3倍，这既能够大幅度节省制剂生产商的检验成本，粗略估算原料检测成本能够节约人民币9元/kg；同时，也便于物流、仓储和生产管理。

三是酶法产品是通过生物酶一步到位生产而得，以纯净水为介质，不使用传统化学工艺中的特殊化工原料，有机溶剂的使用量大幅度减少90%，废水排放减少80%，品质更纯净。

1 青霉素酰化酶的发展

青霉素酰化酶是从微生物或其代谢产物中发现的一类具有特定活性的蛋白质。能够产生青霉素酰化酶的微生物广泛分布于细菌、放线菌、真菌和酵母中,如:醋酸杆菌、假单胞菌、粪产碱菌、黄单胞菌、产气单胞菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、枝状杆菌、克氏梭菌( Kluyvera) 等,其中常用的有巴氏醋酸杆菌、粪产碱

菌、巨大芽孢杆菌、柑橘黄单胞菌和大肠杆菌,尤以大肠杆菌最为常用。为了获得廉价高效的青霉素酰化酶,人们对大肠杆菌等进行了选育和基因改造,用获得的大肠杆菌天然或工程菌株进行工业化生产而得到所需要的酶。

从大肠杆菌或其他微生物获得的酶可以以游离的形式使用,也可以被固定在载体上制成固定化酶( Immobilized Enzyme) 使用。与液体酶(酶溶液) 相比,固定化酶的主要优点是: ①酶和反应液易于分离,酶可重复使用。②稳定性高于天然酶。③有利于反应过程的连续化和自动化控制。④反应液中残留杂质少,有利于产品质量控制。⑤产品的生产成本低廉。从微生物发酵提纯的酶溶液制备固定化酶的方法大致可分为吸附法、包埋法和共价结合法三大类。共价结合法具有酶与载体结合牢固、不易脱离等优点,因此应用较多。其工艺过程为:浓缩酶溶液在缓冲溶液中与交联剂(如戊二醛) 和高分子载体进行振荡偶合,然后过滤洗涤得到固定化酶,所得固定化酶因其载体形态不同大致分为纤维状和颗粒状2 种。近年来使用颗粒状固定化酶比较普遍。用做固定化酶载体的高分子材料有:聚丙烯纤维、醋酸纤维、聚氨酯泡沫树脂、环氧树脂、丫内酯树脂等。

2 青霉素催化内酰胺抗生素合成研究

酶法合成一内酰胺类抗生素可以通过动力学或热力学控制完成。动力学控制的合成反应的产量取决于酶催化的3种不同反应的速率：(1) 一内酰胺类化合物的合成反应；(2)活化的酰基供体的水解反应；(3)合成的抗生素的水解反应。反应过程中青霉素酰化酶同样具有水解活性，通过固定生物催化剂，选择适宜的溶剂，调节反应条件，提供高浓度的活化侧链供体及一内酰胺核等一系列条件可以减少水解反应。合成过程涉及适宜的亲核试剂(如6一氨基青霉烷酸、7一氨基头孢霉烷酸、7一氨基脱乙酰氧头孢霉烯酸)，在低pH值条件下的直接酰化作用。低pH值条件下，大多数底物以非解离状态存在，有利于合成，因此采用水／有机溶剂混合溶剂减少了离子化形式的底物，从而有助于一内酰胺抗生素的合成。Fernandez等在含50％(体积分数)的有机溶剂的非常规介质中，利用来自于E．coli及Kluyvera citrophila的固定化青霉素G酰化酶成功地合成了抗生素。然而，有机溶剂对酶有一定的抑制作用，从而使酶的活性降低。目前的解决方法主要是利用固定化技术增强酶在不利介质中的稳定性，如将酶共价结合到载体上，使其稳定性大大提高。当存在高浓度的有机助溶剂时，在固定化酶分子周围人工建立一个微环境可以增强酶的稳定性，并使酶活性损失最小。

酶法缩合过程是一个非常复杂的动力学过程,它既可以发生底物间的缩合反应,同时又使产物发生酶解反应,此种可逆反应过程又由同一种酶来催化完成。除了酶本身的因素外,反应体系中的其他条件都会对反应程度有不同的影响,如:反应体系温度、pH 值,反应底物的纯度及浓度,反应原料带入的杂质和反应过程中产生的副产物及反应体系电解质浓度,反应产物的浓度等等。

3 阿莫西林研究现状

自20世纪90年代以来,阿莫西林己进入快速发展的黄金时期,从原料到制剂,该品种每年均以超过20%的幅度增长,已成为抗生素品种中最引人注目、发展最快的品种之一。工业上通常使用化学方法合成阿莫西林,这个过程步骤繁多,条件苛刻,而且需要大量有毒、难于降解的有机试剂,成本很高,污染严重。酶促合成可以简化合成工艺,降低所需成本。

而且目前的阿莫西林酶法合成工艺是一种悬浊液－悬浊液体系(Suspension．Suspension System)，这一体系指的是反应前的混合物主要由悬浮在过饱和液相中的固体反应物所组成，反应后的混合物则主要由固体产物所组成，也称为固．固体系(Solid．Solid System)。在这种体系中，底物和产物主要以不溶的微粒存在，而酶促反应则在液相中发生。与一般的酶促反应相比，其单位体积溶剂的产率获得了很大提高。在热力学控制合成的悬浊液．悬浊液体系中，如果达到平衡时的理论产物浓度比溶解度高，产物会在平衡之前达到过饱和状态并从反应混合物中沉淀出来。这个过程一直持续到一种反应物浓度降到溶解度以下，新的平衡建立为止。这样，起始混合物中的固体反应物几乎都转化成了固体产物，产率得到很大提高。由于反应平衡是由产物沉淀推动的，这种悬浊液一悬浊液体系又被称为沉淀推动法(Precipitation—Driven Synthesis)。

动力学控制合成的悬浊液．悬浊液体系则要复杂的多，包括多个子过程，比如底物和产物的溶解和结晶，产物的酶促合成，底物和产物的酶促水解等。而且，由于反应物和产物都是弱电解质，动力学悬浊液．悬浊液体系的各个子过程受pH值的影响特别大，同时也反过来影响pH值。

酶法阿莫西林国内外生产概况：

阿莫西林自问世以来，因疗效确切、抗菌谱广、治疗方便的优势，在临床应用上迅速取代青霉素成为用量第一的β内酰胺抗生素。