荧光分析法基本概念(20210127011514)
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荧光法荧光分析法1荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。
2荧光分析法是根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。
荧光分析法的优点：灵敏度高，选择性好，比紫外可见分光光度法低3个数量级以上。
3振动弛豫：处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。
（非辐射跃迁）4内部能量转换：简称内转换，是当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。
5荧光发射：无论分子最初处于哪一个激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。
（辐射）6外部能量转换：简称外转换，是溶液中的激发态分子与溶剂分子或与其他溶质分子之间互相碰撞而失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。
（非辐射)7体系间跨越：是处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。
（非辐射）8磷光发射：经过体系间跨越的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出光辐射，这种光辐射称为磷光。
磷光的坡长比荧光更长。
9溶液荧光光谱的特征：①斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发光波长。
激发态分子通过内转换和振动弛豫过程而迅速到达第一激发单重态S1的最低振动能级。
②荧光光谱的形状与激发波长无关，荧光发射光谱只有一个发射带。
③荧光光谱与激发光谱的镜像关系。
10影响荧光强度的外部因素：⑴温度（温度升高溶液中荧光物质的荧光效率和荧光强度将降低）；⑵溶剂（荧光波长随着溶剂极性的增强而长移，荧光强度也增强）；⑶酸度（每一种荧光物质都有它最适宜的发射荧光的存在形式，也就是它最适宜的PH范围）；⑷荧光熄灭剂（是指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象；荧光熄灭的原因：①因荧光物质分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量；②荧光物质的分子与熄灭剂分子作用生成了本身不发光的配位化合物；③溶解氧的存在，使荧光物质氧化，或是由于氧分子的顺磁性，促进了体系间跨越，使激发单重态的荧光分子转变至三重态；④浓度较大时，还发生自熄灭现象）⒂散射光。
荧光分析法的基本原理
荧光分析法的基本原理
荧光分析法是一种常用的分析化学方法，它利用物质在受到激发后发出的荧光
来进行定量或定性分析。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、分析速度快等优点，因此在生物医学、环境监测、食品安全等领域得到了广泛的应用。
荧光分析法的基本原理是物质受到激发后发出的荧光强度与其浓度成正比。
当
物质受到特定波长的激发光照射后，其中的分子会吸收能量并处于激发态，随后分子会自发地返回基态并释放出能量，这种能量以荧光的形式发射出来。
荧光分析法利用荧光强度与物质浓度的关系来进行分析，通过测量样品的荧光强度，可以间接地推断出样品中目标物质的浓度。
荧光分析法的基本原理还包括激发光源、激发光和荧光检测器。
激发光源通常
采用紫外灯或激光器，用于提供足够的能量来激发样品中的分子。
激发光是指对样品进行激发的光线，其波长通常由样品的特性决定。
荧光检测器则用于测量样品发出的荧光强度，并将其转化为电信号进行处理和分析。
在实际应用中，荧光分析法可以应用于各种领域。
在生物医学领域，荧光分析
法可以用于检测生物标记物、药物浓度、蛋白质含量等，具有灵敏度高、特异性强的优点。
在环境监测领域，荧光分析法可以用于检测水体中的重金属离子、有机物污染物等，能够快速、准确地进行分析。
在食品安全领域，荧光分析法可以用于检测食品中的添加剂、农药残留、重金属等有害物质，为食品安全提供可靠的分析手段。
总之，荧光分析法作为一种灵敏度高、选择性好的分析方法，具有广泛的应用
前景。
通过深入理解荧光分析法的基本原理，结合实际应用需求，可以更好地利用这一分析方法，为各个领域的分析工作提供更加准确、快速、可靠的支持。
荧光分析法
光致发光：
吸收某种波长的光后发射出比吸 收波长更长的光的现象。 (荧光和磷光)
荧光分析法 (fluorormetry)
荧光光谱→定性分析 荧光强度→定量分析 分类： 原子荧光分析、分子荧光分析
紫外-可见荧光分析 红外荧光分析 X射线荧光分析
第一节 基本原理 一、分子荧光
（一）分子荧光的产生 1、分子的电子能级与激发过程
=
hc
E
2、荧光的产生
振动驰豫
内转换 体系间跨越
磷光
吸收
荧光
外转换
振动驰豫
发生在同一电子能级内，分子通过
碰撞以热的形式损失部分能量，从较高
振动能级下降到该电子能级的最低振动
能级上。无辐射跃迁。
内转换
即激发态分子将多余的能量转变 为热能，从较高电子能级降至较低的 电子能级。内转换也属于无辐射跃迁。
OHH+
NH-
pH<2
pH7~12 兰色荧光
pH>13
荧光熄灭
荧光熄灭（荧光猝灭）：由于荧光物质分子与 溶剂分子或其它溶质分子碰撞而引起荧光强度 降低或荧光强度与浓度不呈线性关系的现象。 荧光熄灭剂(quenching medium)：引起荧光熄灭 的物质。如卤素离子、重金属离子、氧分子以 及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合 物均为常见的荧光熄灭剂。
外转换
荧光 较高激发态分子经无辐射跃迁降 至第一电子激发单重态的最低振动能 级后，仍不稳定，停留较短时间后
（约 10-8 s ，称作荧光寿命），以光
辐射形式放出能量，回到基态各振动
能级，这时所发射的光称为荧光。
系间跨跃
第一电子激发态的最低振动能级经过另一 个无辐射跃迁转移至激发三重态，称为系间跨 跃。
荧光分析法课件
荧光光谱（fluorecence spectrum）：固定激发 光波长为最大激发波长，而让荧光物质发射的 荧光通过发射单色器分光扫描并检测不同波长 下的荧光强度，以发射波长为横坐标，荧光强 度为纵坐标作图，得到物质的荧光光谱。
荧光分析法
荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从第 一激发单重态的最低振动能级返回基态时发射 出的光。 荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强 度进行物质鉴定和含量测定的方法。 优点：灵敏度高；选择性好；试样量少；方法 简单。
缺点：应用范围小。
第一节 荧光分析法的基本原理
一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 1.分子的电子能级与激发过程
磷光发射：激发分子由第一激发三重态的最低振动 能级跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称 为磷光；磷光辐射能要比荧光辐射能量低，磷光波 长大于荧光波长；磷光发射时间为10-4-10s。
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
量
发
吸
射
收
荧
光
S0
l1
l2
l 2
外转换
l3
T1 T2
发 射 磷 振动弛豫 光
水 乙醇 环己烷 CCl4 CHCl3
激发光(nm)
248 313 365 405 436
271 350 416 469 511 267 344 409 459 500 267 344 408 458 499 — 320 375 418 450 — 346 410 461 502
第二节 荧光定量分析方法
荧光分析法 PPT
种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不
是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念， 他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。
1867 年， Goppelsroder 进行了历史上首次的荧光分析工作，
应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由 Jette和West提出了第一台荧光计。
光外还会发射出比原来吸收波长更长的光，当激发光停 止照射后，这种光线随之消失。这种现象称为光致发光。 最常见的是荧光和磷光。
荧光：物质分子接受光子能量激发后，从激发态的最低
振动能级返回基态时发射出的光。
荧光分析法：基于对化合物的荧光光谱测量建立起来的
分析方法。
分类：分子荧光和原子荧光。
根据激发光的波长范围可分为紫外-可见荧光；红外 荧光和X射线荧光。
荧光分析法 (Fluorometry)
1
第一次记录荧光现象的是 16世纪西班牙的内科医生和植物学家 N.Monardes ， 1575 年 他 提 到 在 含 有 一 种 称 为 “ Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝 色。 直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光 度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这
2
,l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最
低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l ‘2 )。
12
外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生
相互作用而转移能量的非辐射跃迁；
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
体系间跨越：处在激发态的电子发生自旋反转
荧光分析法的原理和应用有哪些
荧光分析法的原理和应用有哪些1. 原理荧光分析法是一种利用物质在受到激发后发射荧光的光谱分析方法。
其原理是通过物质在受到光激发后，能量被转移到某些特定的电子能级上，然后由该能级经历跃迁发射荧光的过程。
荧光分析法的原理主要包括下面几个方面：•荧光激发：将样品暴露在激发光源下，激发光的特定波长和强度能够激发荧光染料或被测物质中的相应电子跃迁。
•荧光发射：物质受到激发后，电子由激发态返回基态，产生特定波长的荧光发射。
荧光的发射波长和强度与样品中的化学成分和浓度有关。
•荧光信号检测：通过荧光光谱仪等检测设备测量样品发出的荧光信号，获得荧光强度和发射波长的信息。
2. 应用荧光分析法在许多领域有着广泛的应用。
下面列举了几种常见的应用：2.1 荧光显微镜荧光显微镜利用荧光分析法原理，结合显微镜观察和荧光的发射特性，可以用于生物学、医学、材料科学等领域的研究。
通过标记荧光染料来观察或追踪细胞、分子或其他生物体的结构和功能。
2.2 荧光光谱仪荧光光谱仪是一种用于测量样品荧光发射光谱的仪器。
它可以用于分析和定量测量不同类型的化合物，例如荧光染料、生物分子、环境污染物等。
荧光光谱仪广泛应用于分析化学、生物化学、环境科学等领域。
2.3 荧光染料的标记和追踪荧光染料在生物医学研究、生命科学和分子生物学等领域中被广泛用作标记和追踪剂。
通过将荧光染料与分析目标物相结合，可以实现对生物分子、细胞、组织和病原体等的定位和追踪。
2.4 荧光传感器荧光分析法还可以用于制备荧光传感器，用于检测和定量分析化学物质。
这些传感器可以通过与特定的化学物质相互作用，产生特定的荧光响应，从而实现对目标化合物的检测和测量。
2.5 荧光生物成像荧光分析法在生物医学成像中有着重要的应用。
通过标记荧光分子，可以实现对生物体内部结构和功能的成像观察。
荧光生物成像技术在癌症研究、药物筛选、生物反应动力学等方面具有潜在的应用价值。
3. 总结荧光分析法是一种基于荧光现象的光谱分析方法，具有灵敏度高、选择性好、非破坏性等优点。
荧光分析法误差分析
02
荧光分析法误差来源及分类
误差来源概述
误差来源可以分为系统误差和随机误差
• 系统误差是由实验条件、仪器等因素引起的误差 • 随机误差是由实验操作、测量误差等因素引起的误差
误差来源还可以分为固有误差和附加误差
• 固有误差是由实验方法本身引起的误差 • 附加误差是由实验条件、仪器等因素引起的误差
系统误差及其产生原因
荧光分析法与常见分析方法的比较
荧光分析法与其他光学分析方法的比较
• 与吸收光谱法相比，荧光分析法具有更高的灵敏度和选 择性 • 与发射光谱法相比，荧光分析法可以检测到更多的荧光 物质
荧光分析法与其他分析方法的比较
• 与化学分析法相比，荧光分析法具有更高的灵敏度和选 择性 • 与生物学方法相比，荧光分析法具有更高的灵敏度和准 确性
荧光分析法误差分析
SMART CREATE
CREATE TOGETHER
01
荧光分析法基本原理及应用
荧光分析法的定义与原理概述
荧光分析法是一种光学分析方法
• 利用荧光物质在受激发状态下产生的荧光信号进行定量或定性分析 • 荧光信号强度与荧光物质的浓度呈线性关系
荧光分析法的原理
• 荧光物质在激发光源的作用下吸收能量 • 激发后的荧光物质在发射光源的作用下产生荧光信号 • 通过检测荧光信号的强度和波长进行分析
实验数据处理
• 数据转换：将实验数据转换为适合分析的数据形式 • 数据拟合：通过拟合函数拟合实验数据，如线性拟合、 非线性拟合等
误差评估与数据处理实例
误差评估实例
• 荧光强度测量误差：计算荧光强度测量的误差范围 • 荧光寿命测量误差：计算荧光寿命测量的误差范围
数据处理实例
• 荧光强度数据处理：将荧光强度数据转换为对数形式 • 荧光寿命数据处理：通过线性拟合拟合荧光寿命数据
荧光分析法的基本原理
荧光分析法的基本原理荧光分析法是一种常用的分析技术，它利用样品在受到激发光照射后发出的荧光信号来进行分析。
该方法具有灵敏度高、选择性好、操作简便等优点，在生物医药、环境监测、食品安全等领域得到了广泛的应用。
荧光分析法的基本原理是基于物质在受到激发光照射后会发出荧光的特性。
当分子处于基态时，吸收一定波长的激发光后，电子跃迁至激发态，再从激发态返回基态时会放出荧光。
荧光分析法利用这一原理，通过测量样品在受到激发光后发出的荧光强度来确定样品中所含物质的种类和含量。
在荧光分析法中，激发光源会激发样品中的分子，使其处于激发态，然后测量样品发出的荧光信号。
荧光信号的强度和波长分布可以提供关于样品成分和结构的信息。
通过测量样品的荧光强度和波长分布，可以对样品中的化合物进行定性和定量分析。
荧光分析法的基本原理包括激发和发射两个过程。
激发过程是指样品受到激发光照射后，分子从基态跃迁至激发态的过程；发射过程是指分子从激发态返回基态时发出荧光的过程。
荧光分析法利用这两个过程进行分析，可以实现对样品中微量物质的高灵敏度检测。
荧光分析法的灵敏度高，可以检测到样品中极微量的物质。
同时，荧光分析法具有良好的选择性，可以通过选择合适的激发光源和检测波长，对不同物质进行区分和分析。
此外，荧光分析法的操作简便，只需一台荧光分析仪和相应的荧光标记剂即可进行分析，无需复杂的前处理步骤，适用于现场快速检测和大样品量分析。
总之，荧光分析法是一种灵敏度高、选择性好、操作简便的分析技术，具有广泛的应用前景。
随着荧光标记技术和荧光分析仪器的不断发展，荧光分析法将在生物医药、环境监测、食品安全等领域发挥越来越重要的作用。
荧光分析法.ppt
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11.2.2
激发光谱与发射（荧光）光谱
——荧光物质分子的两个特征光谱
发射波长
激发波长
&激发光谱(excitation spectrum)： F~ ex &荧光光谱(fluorescence spectrum)： F~ em
激发光谱：（与吸收光谱类似）表示不同激发波长的辐射引起
激发光谱 激发光谱
荧光光谱 荧光光谱
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5、磷光（phosporescence）
过程：电子由三重态的第一激发态最低振动能级跃迁到基态的 任一振动能级而发射的光量子为磷光 特点：发生在激发三重态最低振动能级与基态之间。分子在三 重态的最低振动能级上可以存活一段时间，发射时间约
为10-4～10 s。
特点：发生在同一个电子能级内不同振动能级间的跃迁；时
间约10-12秒。
或
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2、内部能量转换（internal conversion)
过程：当两个电子的能级非常靠近，以致其振动能级有重叠
时，电子常常由高电子能级以非辐射跃迁方式转移至低 电子能级，这种过程称为内部能量转换 特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有 重叠；时间约10-1～10-13秒。
结果：这种跨越会导致荧光强度减弱，甚至熄灭。
续前 影响体系间跨越几率增大的因素：
Ø含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。
原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运
动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反
转的发生。 Ø在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体
系间跨越的发生几率。
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注：
发射磷光的能量比荧光的能量小
荧光分析法
F
λem 单色器 λex 固定 λem
改变
检测器
2021/4/9
λ
21
荧光光谱具有以下特征： （1）荧光光谱的形状与激发波长无关
荧光发射通常发生于第一电子激发态的 最低振动能级，与激发至哪一个电子激发 态无关，所以荧光光谱的形态通常与激发 波长无关。
荧光光谱只有一个发射带
2021/4/9
22
（2）荧光光谱与激发光谱呈镜像关系
第二激发态
第一激发态
2021/4/9
电子能级
振动能级
9
特点：荧光的能量小于激发光能量。 荧光发射所需时间为10-9~10-7s。
2021/4/9
10
（4）外部能量的转移
激发态分子与溶剂分子及其它溶质分子之间 相互碰撞而失去能量，常以热能的形式放出。
常发生在第一激发单线态或第一激发三线态 的最低振动能级向基态转换的过程中
（6）磷光：经过体系间跨越的分子降至三线 态最低能级，跃迁至基态而发生的光。
电子能级
振动能级
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13
特点：（1）λ（磷光）>λ（荧光） （2）寿命10-4—10s （3）室温下溶液很少呈现磷光（需冷冻）
处于激发态的分子回基态的途径： ①发射荧光 ②发射磷光 ③内部能量转换 ④ 外部能量转换
外部能量转换可降低荧光强度，有时也称为 荧光猝灭或荧光熄灭。
2021/4/9
11
（5）体系间的跨越 激发态分子的电子发生自旋反转，其多重性发
生变化（激发单线态—激发三线态）
发生条件：物质中含有重原子如Br、I等
电子能级
振动能级
分子由激发单线态跨越到三线态后，荧光强度减弱
甚至熄灭。
荧光分析法
射时间长,约为10-4~10
秒（原因是分子激发三 重态的寿命较长） 。
S2* S1*
b
ν ν ν ν ν02134
c
b
ν ν ν ν ν02134
e
ννννν02134
T1
S0
a
d
f
ννννν02134
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨 越；f.磷光
二、基本原理
• 4、影响荧光强度的外部因素
b. 光致发光：指处于激发态的分子或原子通过发射出 一定波长的光，以辐射的形式回到基态，这种能级的 变化叫光致发光(辐射跃迁)。
▲最常见的两种光致发光：荧光和磷光。
二、基本原理
• 2、激发光谱和发射光谱
（1）激发光谱 （excitation spectrum)
它指不同激发波长的辐 射引起物质发射某一波长的 荧光所得的光谱。即固定发 射光波长λem ，依次改变激 发波长λex测荧光强度F， 以F-λ激作得荧光物质的激 发光谱（见右图（a))。
b
ννννν02134
c
b
ννννν02134
e
ννννν02134
T1
特点：两个电子的能级 非常靠近以致其振动能 级有重叠时内部转换易
S0
a
d
f
ννννν02134
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨 越；f.磷光
发生。 10-1~10-13秒可
荧光和磷光产生的示意图
完成。
H H
H
H
反式强荧光
顺式无荧光
对于顺反异构体，顺式分子的两个基团在同一 侧，由于空间位阻原因使分子不能共平面而没有荧光。
荧光分析法2.
⒊荧光光谱的形状与激发波长无关 用不同波长的激发光激发荧光分子，可以观
察到形状相同的荧光发射光谱。 这是由于荧光分子无论被激发到哪一个激发
态，处于激发态的分子经振动弛豫及内转换等过 程后最终回到第一激发态的最低振动能级。而分 子的荧光发射总是从第一激发态的最低振动能级 跃迁到基态的各振动能级上。
五、影响荧光强度的因素
㈡发光分子所处的环境 荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的影
响。因此适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的灵敏 度和选择性。
㈠分子结构
⑴跃迁类型：
大多数荧光化合物多是由π→π＊或n→π＊跃 迁所致的激发态去活后，发生π＊→π或π＊→n 跃迁产生的。
π＊→π跃迁的量子效率高，是由于π→π＊ 跃迁的摩尔吸光系数比n→π＊跃迁大100～1000 倍,跃迁的寿命(10-7 ～10-9s)又比n→π＊(10-5 ～
荧光的去激发过程：
①发射荧光返回基态(强的荧光物）
②无辐射跃迁回到基态(低荧光物质)
三、荧光的激发光谱和发射光谱
任何荧光分子都具有两种特征的光谱，即激 发光谱和荧光光谱。 ⒈荧光激发光谱
激发光谱是通过固定发射波长，扫描激发波
长而获得的荧光强度(F)—激发波长(λex)的关系
曲线。 激发光谱反映了在某一固定的发射波长下，
一般地，随温度降低，溶液中荧光效率和荧 光强度将增大，并伴随光谱的蓝移。
因此，选择低温条件进行荧光检测将有利于 提高分析的灵敏度。
⑶pH的影响
①对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言， 溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的 影响。 如：在pH7～12的溶液中，苯胺以分子形式存 在，产生蓝色荧光；
不同激发波长激发的荧光的相对效率。 激发光谱可以用于荧光物质的鉴别，并作为
第十一章 荧光分析法
（3）系间跨跃（isc） 单线态的较低振动能级（s1）与三重态 T1 的较高振动能 级有重叠，电子有可能发生自旋状态改变而发生系间跨跃。 如含有碘溴等分子系间跨越最常见。 （4）荧光发射： 通过内转换和振动驰豫，较高能级的电子均跃回到第一 电子激发态（S1）的最低振动能级（V0=0）上。处于激发单 重态的最低振动能级的分子，若以 10-9~10-7S 左右时间发射 光子回到基态的各振动能级，这一过程就有荧光发生，称为 荧光发射。 （5）磷光发射（P）： 分子经系间跨跃迁后，接着就发生快速振动驰豫而达到 三重激发态 T1 的最低振动能级（V=0）上，再跃迁到基态的 各振动能级就能发磷光。 （T：10-4~10S） （6）激发分子与溶剂分了或其它溶质分子间相互作用， 发生能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失，这一现象 称为“淬灭”。 二、激发光谱和发射光谱
波长相同，也可以不同，这一现象我们称为光致发光。最常
见 两 种 光 致 发 光 现 象 是 荧 光 （ Fluorometry ） 和 磷 光
（Phosphorscence）。
这两种过程的机理不同。
10-15s M+hr → M*
hr1→M hr→M
物质分子吸收光子能量而被激发，然后从第一激发态最
低振动能级返回到基态时各振动能级所发射出的光称为荧
１０
位阻使共平面下降则荧光减弱。例 P89 顺反异构体分子，顺式分子的两个荃团在同一侧，由于 位阻原因使分子不能共平面而没有荧光。 1-2 一二苯乙烯的反式结构有强烈荧光，而顺式异构体 （b）无荧光。
3.苯环取代基的类型： 芳香化合物的芳香环上，不同取代基对论化合物的荧光 强度和荧光光谱将有很大影响。规律如下： 给电子基团使荧光效率增强：如-OH,-NH2,-NHR,NR2,-OR 等； 吸电子基团：-COOH，-C=0，-NO2，-NO，-N=N-及卤素会 减弱甚至破坏荧光，且卤素随原子序数的增大，会使下 T1 体系的磷光增强，荧光减弱了解物质分子结构和荧光的关系， 可以帮助我们考虑如何将非荧光物质转化为荧光物质，或将 荧光强度不大或选择性不多的荧光物质转化为荧光强度大及 选择性高的荧光物质，以提高分析的效果。对 T1 电子共轭体 系作用小：-R，NH3+，-SO31-1
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紫外可见吸收光谱 一紫外吸收光谱分析 基于物质对200-80Onm光谱区辐射的吸收特性而建立起来的分 析测定方法称为紫外-可见吸收光谱法或紫外-可见分光光度法。它属 于分子吸收光谱，是由于分子内电子跃迁而产生的光谱。 二紫外光谱的产生 物质分子的能量具有量子化的特征（即物质分子的能量具有不 连续的特征）。一个分子有一系列能级，其中包括许多电子能级，分 子振动能级以及分子转动能级。分子吸收特定的波长的光而产生吸收 光谱 分子的紫外吸收光谱是由于 分子中价电子的跃迁 而产生的，从化 学键的性质上考虑，与电子光谱有关的主要是三种电子： （1）形成 单键的°电子；（2）形成双键的n电子；（3）分子中非键电子即n 电子。 化合物不同，所含的价电子类型不同，所产生的电子跃迁类型不 同，根据分子轨道理论，分子中这三种电子能级的高低次序大致是： （c）v（n）v（ n）V（n * ）V （厂） ° , n是成键轨
道，n是非键轨道，° * , n *是反键轨道 由于电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。 即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线 而呈现宽谱带。 二紫外光谱的表示方法 紫外光谱图是由横坐标、纵坐标和吸收曲线组成的。 横坐标表示吸收光的波长，用nm （纳米）为单位。 纵坐标表示吸收光的吸收强度，可以用 A（吸光度）、T（透射比 或透光率或透过率）、1-T（吸收率）、（吸收系数）中的任何一个 来表示。 吸收曲线表示化合物的紫外吸收情况。曲线最大吸收峰的横坐标 为该吸收峰的位置，纵坐标为它的吸收强度。
入/nm 翠胺的紫外光谱图
四、紫外光谱中常用的几个术语 1. 发色基团和助色基团
团，不论是否显示颜色都称为发色基团。 一般不饱和的基团都是发色 基团（C=C C=O N=N、三键、苯环等）
助色基团：指那些本身不会使化合物分子产生颜色或者在紫外
发色基团：是能导致化合物在紫外及可见光区产 生吸收的基 及可见光区不产生吸收的一些基团，但这些基团与发色基团相连时却 能使发色基团的吸收带波长移向长波， 同时使吸收强度增加。助色基 团通常是由含有孤对电子的元素所组成( -NH2 , -NR 2 , -OH ,
-OR , -Cl等)，这些基团借助P- n共轭使发色基团增加共轭程度， 从而使电
子跃迁的能量下降。 2. 红移、蓝移、增色效应和减色效应
由于有机化合物分子中引入了助色基团或其他发色基团而产生 结构的改变、或者由于溶剂的影响使其紫外吸收带的最大吸收波长向 长波方向移动的现象称为红移。与此相反，如果吸收带的最大吸收波 长向短波方向移动，则称为蓝移。 由于化合物分子结构中引入取代基或受溶剂的影响，使吸收带 的强度即摩尔吸光系数增大或减少的现象称为增色效应或减色效应、
分子荧光分析法 一、荧光的产生 物质分子的能级包括一系列电子能级、 振动能级和转动能级。分子吸 收能量后，从基态最低振动能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激 发态的不同振动能级(这一过程速度很快，大约 10-15 s ),成为激发
单重态分子。激发态分子不稳定，可以通过以下几种途径释放能量返 上。由于这一部分能量以热的形式释放，而不是以光辐射形式发出, 故振动驰豫属于无辐射跃迁。 2. 内转换
即激发态分子将多余的能量转变为热能，从较高电子能级降至较 低的电子能级。内转换也属于无辐射跃迁 3. 系间窜跃
有些物质的激发态分子通过振动驰豫和内转换下降到第一电子 激发态的最低振动能级后，有可能经过另一个无辐射跃迁转移至激发 三重态，这一过程伴随着自旋方向的改变，称为系间窜跃。对于大多 数物质，系间窜跃是禁阻的。如果分子中有重原子（如 I、Br等）存 在，由于自旋-轨道的强偶合作用，电子自旋方向可以改变，系间窜 跃就变得容易了 4. 磷光
经系间窜跃的分子再通过振动驰豫降至激发三重态的最低振动 能级，停留一段时间（10-4〜10s,称作磷光寿命），然后以光辐射形 式放出能量返回到基态各振动能级，这时发出的光称为磷光 （phosphoresce nee）。由于激发三重态能量比激发单重态最低振动能 级能量低，故磷光辐射的能量比荧光更小，即磷光的波长比荧光更长 、|/ .荧光
较高激发态分子经无辐射跃迁降至第一电子激发单重态的最低 振动能级后，仍不稳定，停留较短时间后（约10-8 s,称作荧光寿命）， 以光辐
射形式放出能量，回到基态各振动能级，这时所发射的光称为 荧光。当然也可以无辐射跃迁形式返回基态 二、激发光谱和荧光光谱 荧光检测 光源发出的紫外可见光通过激发单色器分出不同波长的激发光， 照射 到样品溶液上，激发样品产生荧光。样品发出的荧光为宽带光谱，需 通过发射单色器分光后再进入检测器， 检测不同发射波长下的荧光强 度F。由于激发光不可能完全被吸收，可透过溶液，为了防止透射光 对荧光测定的干扰， 常在与激发光垂直的方向检测荧光 （因荧光是向 各个方向发射的） 。 激发光谱与荧光发射光谱的形成 任何荧光物质，都具有两种特征光谱，即激发光谱 （excitation spectrum） 和荧光发射光谱 （fluorescence emission spectrum） 。
1. 激发光谱
保持荧光发射波长不变（即固定发射单色器） ，依次改变激发光 波长（即调节激发单色器） ，测定不同波长的激发光激发下得到的荧 光强度F （即激发光波长扫描）。然后以激发光波长为横坐标，以荧 光强度F为纵坐标作图，就可得到该荧光物质的激发光谱。 激发光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最大激发波长， 是激发荧光最灵敏的波长。 物质的激发光谱与它的吸收光谱相似， 所 不同的是纵坐标。 2. 荧光光谱
5 荧光光谱，又称发射光谱。保持激发光波长不变（即固定激发 单色器），依次改变荧光发射波长，测定样品在不同波长处发射的荧 光强度F。以发射波长为横坐标，以荧光强度 F为纵坐标作图，得到 荧光发射
光谱。荧光发射光谱上荧光强度最大值所对应的波长就是最 大发射波长 发射光谱与激发光谱的关系 1. 发射光谱形状与激发光波长无关 由于荧光是分子从第一电子激 发态的最低
振动能级返回到基态的各振动能级时释放的光辐射， 与分 子被激发至哪一个电子激发态无关。 2. 发射光谱比激发光谱波长为长
由于分子吸收激发光被激发至较高激发态后， 先经无辐射跃迁（振 动驰豫、内转换） 损失掉一部分能量，到达第一电子激发态的最低振 动能级，再由此发出荧光。因此，荧光发射能量比激发光能量低，发 射光谱波长比激发光波长长。 3. 镜像对称
对于高度对称的有机分子， 其荧光发射光谱与吸收光谱呈镜像对称 关系。 解释：能级结构相似性 荧光为第一电子激发单重态的最低振动能级跃迁到基态的各个 振动能级而形成，即其形状与基态振动能级分布有关。 激发光谱是由基态最低振动能级跃迁到第一电子激发单重态的 各个振动能级而形成， 即其形状与第一电子激发单重态的振动能级分 布有关。 由于激发态和基态的振动能级分布具有相似性， 因而呈镜像 对称 三、影响荧光产生及荧光强度的因素 1. 物质产生荧光的必要条件 一种物质能否发荧光以及荧光强度的高低， 与它
的分子结构及所处的 环境密切相关。能够发射荧光的物质都应同时具备两个条件： 1. 物质分子必须有强的紫外吸收（有 〜*跃迁）；
2. 物质具有较高的荧光效率（ fluorescence efficiency ）。荧光效 率也称
荧光量子产率，用 f 表示。 可见，凡是使 kF 增加，使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光 量子产率。通常， kF 由分子结构决定（内因） ，而其它参数则由化学 环境和结构共同决定。 2. 影响荧光及其强度的因素
跃迁类型 ：如上所述，物质必须在紫外可见区有强吸收和高荧光效率 才能产生荧光。具有 — * 跃迁的分子才有强吸收。 — * 跃迁的 大。 共轭效应 ：大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环， 具有共轭 的 〜 * 跃迁。其共轭程度愈大， 荧光效率也愈大， 且最大激发和发 射波长都向长
波长方向移动，如苯、萘、蒽三种物质。 苯 萘 — J a、 维生素A
205nm 286nm 356nm 327nm 278nm 321 nm 404nm 510 nm 0.11 0.29 0.36 刚性平面结构：当荧光分子共轭程度相同时，分子的刚性和共平面性 越大，荧光效率越大。 荧光物质（荧光素） 非荧光物质（酚酞） 芴（①=1.0 ） 联苯（①=0.2 ） 有些物质本身不发荧光或荧光较弱，但和金属离子形成配合物 后，如果刚性和共平面性增加，就可以发荧光或增强荧光。如 8-羟 基喹啉是弱荧光物质，与 Mg+、Al3+等金属离子形成的配合物的荧光 增强，利用这一特点可以间接测定金属离子。 8-羟基喹啉 8- 羟基喹啉-铝
取代基团 荧光分子上的各种取代基对分子的荧光光谱和荧光强度都有很 大影响。给电子取代基如一NH、一OH — OCH — CN — NHR — NR 等，能增加分子的n电子共轭程度，使荧光效率提高。而-COOH— NO、 —C=O — F、一 Cl等吸电子取代基，可减弱分子 n电子共轭性，使 荧光减弱甚至熄
灭。还有一类取代基则对荧光的影响不明显， 如一R、 —SOH — NH 等。
温度 温度对被测溶液的荧光强度有明显的影响。 当温度升高时， 介质 粘度减小，分子运动加快， 分子间碰撞几率增加，从而使分子无辐射 跃迁增加， 荧光效率降低。 故降低温度有利于提高荧光效率及荧光强 度。 由于荧光仪器光源的光强度大、温度较高，容易引起溶液温度 升高，加之分析过程中室温可能发生变化，从而导致荧光强度改变。 另外，有些荧光物质的溶液在激发光较长时间的照射下， 还会发生光 分解，使荧光强度下降。因此，试样不应长时间受光照射，只在测定 荧光强度时才打开光闸， 其余时间应关闭。 在较高档的荧光分光光度 计中，样品室四周设有冷却水套或配有恒温装置， 以使溶液的温度在 测定过程中保持恒定。 溶剂 ：同一种荧光物质在不同的溶剂中， 其荧光光谱的位置和荧光强 度可能会有一定的差别， 尤其是那些分子中含有极性取代基的荧光物 质，它们的荧光光谱易受溶剂的影响。