仪器分析第六章 荧光分光光度法
仪器分析测试技术：分光光度法设计
《仪器分析测试技术》
团队协作 自主探索
《仪器分析测试技术》系列课程
分光光度法设计
《仪器分析测试技术》
1. 选择显色反应
2. 选择显色剂
3. 优化显色反应条件
｝ 4. 选择检测波长
5. 选择合适的浓度 6. 选择参比溶液
测量条件选择
7. 建立标准曲线
《仪器分析测试技术》
1、波长
选择一般来说，选择max；如max处有干扰，则选择无干扰处的进行测定
《仪器分析测试技术》
1. 试液与显色剂均无色时，可用蒸馏水作参比。 2. 显色剂为无色，而被测试液中存在其他有色离子，可用不加显色剂的被测试液作参比,试样空白 3. 显色剂有颜色，可选试剂空白作参比 4. 干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时： 1）掩蔽被测组分，再加入显色剂，作参比 2）加入等量干扰组分到空白溶液中,作参比 5.改变加入的顺序，被测液不显色的溶液作参比
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2、 测定浓度控制 控制浓度 吸光度A：0.2～0.8
减少测量误差
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3、 参比溶液选择
参比溶液：光度测量时用来调节仪器的零点的一种溶液。
用途：消除由于吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差，并 扣除干扰的影响。如参比溶液选择不当，会使标准曲线不通过原点。
分光光度法
基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，称为吸光光度法。包括：比色法、可见及紫外吸光光度法和红外光谱法。本章重点介绍：可见吸光光度法。在选定波长下，被测溶液对光的吸收程度与溶液中的吸光物质的浓度有简单的定量关系。吸收光波范围是紫外，可见和红外光区。它所测量的是物质的物理性质－物质对光的吸收，测量所需的仪器是特殊的光学电子学仪器，所以光度法不属于传统的化学分析法，而属于近代的仪器分析，这里只是按照我国现行教学习惯把可见光的光度法作为化学分析部分的一章。
(一)朗伯一比耳定律的推导
当一束平行单色光通过任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被器皿表面反射。设入射的单色光强度为I0，反射光强度为Ir，吸收光强度为Ia，透过光强度为It，则它们之间的关系为：
I0=Ir+Ia+It
因为λ射光常垂直于介质表面射λ，Ir很小(约为λ射光强度的4％)又由于进行光度分析时都采用同样质料，同厚度的吸收池盛装试液及参比溶液，反射光的强度是不变的。因此，由反射所引起的误差可校正，抵消。故上式可简化为：
ΔE=hc/λ
这里，ΔE=E2-E1，表示某一能吸级差的能量。由于不同物质的分子其组成与结构不同，它们所具有的特征能级不同，能级差也不同，所以不同物质对不同波长的光的吸收就具有选择性，有的能吸收，有的不能吸收。在电子能级发生变化时,不可避免地也伴随着分子的振动和转动能级的变化.分子光谱又成为带状光谱.
2、溶液有色的原因。
具有单一波长的光称为单色光，在可见光中，通常所说的白光是由许多不同波长的可见光组成的复合光。由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫这些不同波长的可见光按照一定的比例混合得到白光。进一步的研究又表明，只需要把两种特定颜色的光按一定比例混合，就可以得到白光，如绿光和紫光混合，黄光和蓝光混合，都可以得到白光。
第六章 仪器分析 荧光分析法
第6章 荧光分析法
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低 振动能级→基态（ T1 → S0跃迁）。
1.基本原理
无辐射跃迁方式 振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式 由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。
内转换：能量差较小的激发态之间，部分能量 重叠，激发态由高电子能级转移至低电子能级 的无辐射能级交换。
外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生 相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使 荧光或磷光减弱或“猝灭”。 体系间跨越：不同多重态,有重叠的振动能级间 的非辐射跃迁。
2.荧光分光光度计
（2）单色器 选择激发光波长的第一单色器 选择发射光(测量)波长的第二单色器
（3）样品池
低荧光的玻璃或石英 方形适用于90°测量 （4）检测器 光电倍增管 （5）读出装臵
2.荧光分光光度计
2.2 仪器的校正
(1)灵敏度校正 (2)波长校正 (3)激发光谱和荧光光谱的校正
3.分析方法 3.1 荧光强度与物质浓度的关系
1.基本原理
（3）影响荧光强度的外部因素
① 温度 温度升高，荧光物质的荧光效率和荧光 强度下降。 其中一个原因是分子的内部能量转化作 用。当激发分子接受额外热能时，有可能使 激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振 动弛豫而丧失振动能量。另一个原因是碰撞 频率增加，使外转换的去活几率增加。
1.基本原理
1.基本原理
1.基本原理
仪器分析 第6章 原子吸收分光光度法
(3)火焰： 提供一定的能量使雾滴蒸发，干燥产生气态。
Mx（试样）==Mx（气态）==M（基态原子）+x（气态） 火焰的温度能使分子游离成基态原子即可，不希望离解成
离子，∴要根据元素的性质来选择不同类型的火焰。
2、非焰原子化法： 火焰原子化法缺点：原子利用率低，气流量较大，原子 化效率低等，而非火焰原子化法可提高原子化效率与灵敏度。 （1）石墨炉原子化法： 石墨管5cm长、4mm径、由于试样在容积很小的石墨管
二、原子在各能的分布
在一定火焰下，待测元素的原子不可能全部处
于基态，当热平衡时，基态与激发态原子数目之比
符合玻尔斥曼分布：
Nj N0
gj g0
exp(
E j E0 KT
)
gj—激发态原子统计数量。 go---基态原子统计数量，g=2J+1 Nj/No~T与火焰的温度有关。
例： 2500K 和 2510K 火焰中钠原子激发态 3 2 P3/2 和基态
2 、 Doppler 变宽，热变宽，由原子无规则运动而产生（由
声波引申而来） 例：火车迎面开来，鸣笛声渐响，频率大
火车离我而去，鸣笛声渐粗，频率小
同样，当火焰中的基态原子背向检测器运动时，被检测到 的频率比静止波原发出的频率低——波长红移； 同样，当火焰中的基态原子向着检测器运动时，被检测到 的频率比静止波源发出的频率高——波长紫移。
应控制，当局外元素源子度小时，主要受Doppler效应控制。
由于谱线变宽将使测定灵敏度下降，吸收效率低。是 原子收中值得注意的问题。
四、吸收定律
经推导：A=KNL=K’C（K 原子总数） 吸收度与被测试样中被测组分的浓度成线性关系。（类 似于L-B要求单色光、稀溶液）原子吸收条件。 条件：
仪器分析第六章UVVIS
C
O
CH3
—环己烷 …水
异丙叉丙酮的紫外-可见光谱
二、溶剂极性对吸收光谱精细结构的影响 例如：对称四嗪在不同溶剂中的吸收光谱
Ⅰ：在蒸汽态中 Ⅱ：在环己烷中 Ⅲ：在水中
★
三、正确选择溶剂 溶剂对紫外-可见吸收光谱影响很大，因此选择溶
剂应注意下列要求： 1.对试样有很好的溶解力，且对试样应是惰性的； 2.在溶解度允许的范围内，尽量选择极性较小的
二、配位场跃迁
过渡金属离子及其化合物除了电荷迁移跃 迁外，还有配位场跃迁。
配位场跃迁的产生：过渡金属离子配合物 在配体的配位场作用下，5个能量相等的d 轨道或7个能量相等的f轨道裂分成几组能 量不等的d轨道或f轨道，当物质吸收光能 后，处于低能级的d电子或f电子可分别跃 迁至高能级的d轨道或f轨道，产生吸收光 谱。
最大吸收峰所对应的波长λmax是化合物中电 子能级跃迁时吸收的特征波长，对鉴定化 合物尤为重要，与λmax相应的εmax也是定性 和定量分析的另一重要参数。
整个吸收光谱的形状决定于物质的性质， 反映物质分子内部能级分布状况，是物质 定性的依据。
▲
6.2有机化合物紫外—可见吸收光谱
一、有机化合物电子跃迁类型 紫外-可见吸收光谱是由分子中价电子在电
能复合成白光的两种颜色的光叫互补色光。物 质所显示的颜色是吸收光的互补色。
KMnO4的颜色及吸收光谱
▲
6.1 分子吸收光谱基本原理
一、电子跃迁产生紫外—可见吸收光谱 分子和原子一样，也有它的特征分子能级，
这些能级是由分子内部运动决定的。
①价电子的运动
分子内部运动
②分子内原子在平衡 位置附近的振动
使电子从给予体外层轨道向接受体相应的 轨道跃迁产生吸收光谱，此过程又称内氧 化-还原。
《仪器分析》荧光分析法
500 nm
3.吸收光谱、激发光谱与荧光光为相似。
F
激发光谱
（2）镜像规则 通常荧光光谱与激发光谱（吸收光谱）大致 呈镜像对称。
4 3 2 1
S1
4 3 2 1
S0
（3）Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间 的波长差值。荧光的波长总是大于激发光的波长。
三、样品池
四、检测器
通常用石英杯，四面透光
光电倍增管
与激发光源垂直，为了消除激发光对荧光 测量的干扰
问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度 计有何异同点？
紫外-可见分光光度计:
光源 单色器 样品池 检测器 数据处理 仪器控制
荧光分光光度计:
光源 激发 单色器 样品池 荧光 单色器 检测器 数据处理 仪器控制
荧光法与UV-Vis法的比较： 相同点：
都需要吸收紫外 - 可见光，产生电子能级跃迁。
荧光法与UV-Vis法的比较：
不同点：
UV-Vis法测定的是物质溶液对紫外-可 见光的吸收程度 (A) 。
荧光法测定的是物质经紫外-可见光照 射后发射出的荧光强度(F)。
本章作业
P64 三计算题 1. P65 四简答题 3、4、
紫外-可见分光光度计 吸收池
荧光分光光度计 吸收池
It
It IF,p I0
I0
荧光光度计
第三节
定量分析方法
F= K c （εcL≤0.05 ） —— 定量分析的依据 方法：标准曲线法和标准对比法
1. 标准曲线法——最常用的定量分析方法
浓度 C1 C2 C3 C4 C5 Cx 荧光强度 F1 F2 F3 F4 F5 Fx
荧光分光光度法
荧光分光光度法荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。
通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。
荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。
可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
荧光分光光度法
荧光效率（φf）=
2、分子结构与荧光的关系 A 长的共轭结构 例 激发光 荧光 205nm 278nm 286nm 321nm 0.29 356nm 404nm 0.36
荧光效率 0.11
B 分子的刚性和共平面性
荧光效率：0.2
1.0
C 取代基：给电子基团使荧光效率增大，如 -OH、-OCH3、-NH2等。
表面吸 光物质
F
问题（1）不同强度的光照射物质所产生 的荧光光谱形状是否相同？ （2）不同波长的光照射物质所产生的荧 光光谱是否相同？ 是否影响荧光强度? 单色器
I0
λex
I
表面吸 光物质
λem 单色器
检测器
3、激发光谱：荧光λex不变时，记录荧光 强度F与激发波长之间的关系。
单色器 F荧光的产生
（1）振动弛豫：同一电子能级电子从高的 振动能级到最低的振动能级。
电子能级
原因：分子碰撞 结果：热能，无辐射
振动能级
（2）内部能量的转移
产生原因：受激分子常由高电子能级以无辐射 （热）跃迁方式转移至低电子能级。
电子能级 振动能级
（3）荧光发射 无论分子处于哪一个激发单线态，通过内转换 及振动弛豫，均可返回到第一激发单线态最低 能级，然后以辐射的形式发射光量子而返回到 基态的任一能级。 第二激发态 第一激发态
散射光波长与荧光接近，对荧光强度测定 有干扰，使其读数增大。
荧 光 光 谱
散 射 光 谱
不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长 溶剂 水 248 271 313 350 365 416 405 469 436 511
乙醇
环已烷 四氯化 碳 氯仿
267
267 — —
344
荧光分光光度法原理
荧光分光光度法原理荧光分光光度法是一种基于物质吸收与发射荧光的分析技术。
它利用物质在吸收紫外光能量后，发生电子从基态跃迁到激发态，再经过热辐射和无辐射跃迁的复合过程，从激发态退回基态，释放出的能量以荧光形式发射出来。
通过测量荧光的强度和波长分布，可以对样品中的化合物进行定量和定性分析。
1.激发：激发光源照射样品溶液，激发光源通常为紫外光和可见光，其波长需要与所研究的物质的激发波长匹配。
激发光源经过滤波器选择特定波长的光线，然后通过光导纤维引导到样品室中。
2.激发态产生：样品中的物质吸收光能量，使得物质的电子由基态跃迁到激发态。
激发态的产生取决于样品中的化合物种类，以及激发光源的能量和波长等因素。
3.荧光发射：激发态的物质经过热辐射和无辐射跃迁的复合过程，返回基态。
在这个过程中，部分能量以荧光的形式发射出来。
发射的荧光波长与激发光的波长不同，可以通过光栅或者单色仪分离出来。
4.荧光光谱测量：通过荧光光谱仪对荧光进行测量，荧光光谱仪通常由光栅、检测器（如光电倍增管）和数据采集系统组成。
荧光光谱仪能够选择特定波长范围的荧光进行测量，并将荧光信号转化为电信号。
5.信号处理：荧光信号经过光电器件转换为电信号后，通过放大、调理和滤波等处理，最终通过数据采集系统记录和分析。
荧光分光光度法的优势在于其高灵敏度、高选择性和广泛的应用范围。
它可以应用于环境、食品、制药、生物化学等领域的定量分析和荧光标记分析。
此外，荧光分光光度法还可以结合其他技术，如高效液相色谱、毛细管电泳等，提高其分析的准确性和灵敏度。
荧光分光光度法的一些应用包括：药物分析、痕量元素测定、蛋白质分析、环境污染物检测、核酸分析、生物标记等。
在荧光分析中，还有一些常用的技术方法，如荧光共振能量转移（FRET）、荧光探针和荧光染料等，这些方法进一步扩展了荧光分光光度法的应用范围和分析手段。
总之，荧光分光光度法基于物质的吸收与发射荧光原理，通过测量荧光的强度和波长分布，实现对物质的定量和定性分析。
荧光分光光度法测定维生素 B2的含量
荧光分光光度法测定维生素 B2的含量维生素B2（核黄素）是一种黄色的水溶性维生素，参与人体多种代谢过程，如能量代谢、蛋白质合成及细胞呼吸等。
因此，对维生素B2的含量进行精确测量至关重要。
本文将介绍一种常用的荧光分光光度法测定维生素B2含量的方法。
一、测定原理荧光分光光度法是一种基于物质吸收光谱和荧光光谱的仪器分析法，它利用物质在受激光或外界光源激发下，发生荧光的特性来测定物质的含量。
维生素B2在紫外光530.0nm 处吸收，同时能在pH8.0的碳酸氢钠缓冲溶液中产生荧光。
因此，荧光分光光度法可以通过测定维生素B2产生的荧光强度来计算其含量。
二、测定步骤1.准备样品将要测定的维生素B2溶于50mL的碳酸氢钠缓冲液中，并将其均匀混合。
用已知浓度的维生素B2标准品分别配制成不同浓度的标准溶液，用于绘制标准曲线。
2.测定荧光光谱取适量的样品及标准溶液分别装入荧光分光光度计的比色皿中，然后在含有Excitation (Ex)波长为450.0nm、Emission (Em)波长为530.0nm的荧光滤光片下进行测量。
将标样及待测样荧光强度值分别记录下来。
3.制定标准曲线将已知浓度的维生素B2标准溶液按照步骤2测定，绘制标准曲线，根据数据进行回归分析，得出求出待测样品浓度的公式。
4.检测待测样品按照步骤2进行待测样品的测定，利用标准曲线计算出待测样品中维生素B2的含量。
三、测定注意点1.样品配制时要保持一定浓度，过高或过低都会影响分析结果；2.样品制备、实验条件及荧光光度计的使用必须保证一致性；3.测量结果可受色、浑浊等因素影响，需要有一定的操作经验、严守操作规程。
四、结论本文介绍了荧光分光光度法测定维生素B2含量的方法，并简要说明了测定原理及详细的操作步骤。
此种方法具有测量简便、操作方便、灵敏度高等优点，被广泛应用于维生素B2含量的测量。
荧光分光光度法
荧光分光光度计的结构与操作
1 2 3
荧光分光光度计的结构
荧光分光光度计由光源、单色器、样品池、检测 器等部分组成，各部分协同工作完成荧光光谱的 测量。
荧光分光光度计的操作步骤
操作步骤包括样品准备、仪器调试、参数设置、 数据采集与分析等，操作时应严格按照仪器说明 书进行。
荧光分光光度计的维护与保养
为了保持仪器的性能和延长使用寿命，应定期对 仪器进行维护和保养，如清洁光学元件、检查电 路连接等。
荧光分光光度法
目录
CONTENTS
• 荧光分光光度法简介 • 荧光分光光度法的基本原理 • 荧光分光光度法的实验技术 • 荧光分光光度法的应用实例 • 荧光分光光度法的挑战与展望
01 荧光分光光度法简介
CHAPTER
定义与原理
定义
荧光分光光度法是一种基于荧光物质与激发光的相互作用， 通过测量荧光光谱来研究荧光物质性质的分析方法。
利用荧光染料标记DNA或RNA，通过 荧光光谱法检测基因表达和突变，以 及DNA和RNA的定量分析。
在环境监测领域的应用
污染物检测
荧光分光光度法可用于检测水体、土壤和空气中的有 害物质，如重金属、农药、酚类化合物等。
饮用水安全
通过荧光光谱法检测饮用水中的消毒副产物，确保饮 用水安全。
生态毒理学研究
荧光光谱的定量分析方法
荧光光谱的定量分析原理
荧光光谱的定量分析基于荧光物质浓度与荧 光强度之间的线性关系，通过测量荧光强度 可以推算出荧光物质的浓度。
荧光光谱的定量分析方法
定量分析方法包括标准曲线法、内标法、外标法等 ，应根据实验需求选择合适的分析方法。
荧光光谱的定量分析误差 来源
误差来源包括仪器误差、样品不均匀性、操 作误差等，应采取相应措施减小误差，提高 分析精度。
仪器分析实验思考题
紫外-可见分光光度法：1 紫外光谱法测苯甲酸钠含量的实验中使用的是玻璃吸收池还是石英吸收池？为什么？2 简述紫外-可见分光光度计的基本结构。
3 紫外-可见分光光度计中使用的光源有哪些？4苯甲酸测定中制作A-λ吸收曲线的目的是什么？5采用标准比较法求样品中苯甲酸钠的含量，计算原理是什么？6 荧光分光光度法测药片中VB2含量的实验中使用的比色皿是四面透光还是两面透光？为什么？7 物质的摩尔吸光系数和哪些因素有关？8 实验中如何确定物质的摩尔吸光系数？荧光分光光度法：1 简述荧光-分光光度计的基本结构。
2 荧光分光光度计中使用的光源是什么？3荧光分光光度计中第一单色器和第二单色器为什么不在一条直线上，而是呈90°角？4荧光分光光度法测定物质浓度的基本原理是什么？5荧光分光光度计中使用哪种灯提供光源？简述分子荧光法中维生素B2荧光波长的是多少？原子吸收分光光度法1简述火焰原子分光光度计的基本结构。
2火焰原子分光光度计中使用的光源是什么？3火焰原子分光光度计中，火焰是由哪两种气体燃烧产生的？4原子化器的作用是什么？自动电位滴定法：1电位滴定法测定VB1中Cl含量的实验中，所使用的指示电极和参比电极分别是什么？2电位滴定法较指示剂法有何优点?3 电位滴定法测定VB1中Cl含量的实验中，所使用的标准滴定溶液是什么？4电位滴定法测定VB1中Cl含量的实验中，如何确定滴定终点？5电位滴定法测定VB1中Cl含量的实验中，滴定操作时应注意哪些问题？气相色谱法1简述气相色谱仪的基本结构。
2简述气相色谱法分离原理。
3气相色谱法测定含量的实验中，流动相是什么？纯度有什么要求？4气相色谱法测定含量的实验中，使用的气体有哪些？5气相色谱法测定含量的实验中，使用的检测器是什么？6气相色谱法测定含量的实验中，使用的色谱柱是什么？7气相色谱法测定含量的实验中，定量分析的依据是什么？8常用气相色谱法的定性、主要有哪些定性方法。
荧光光度分析法
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浓度测定 1、如何进行校准和浓度测定 如何进行校准和浓度测定 按以下步骤，调整仪器，以便获取数据 第1步： 点击视图中的开始 开始(Stare)按扭，指向程序 开始 程序 (Program)→Cary Eclipse ， 然后选择扫描 扫描(Scan)即显示扫描功能框。 扫描 第2步： 点击设置 设置(Set up)，进入设置 设置(Set up)对话框， 设置 设置 指定检测方法的参数
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4. 偏离线性关系的原因
⑴内滤效应 图A为一极稀的溶液，在入射光I0照射下所发 为一极稀的溶液，在入射光I 生的荧光均匀地分布在液池中； 生的荧光均匀地分布在液池中；图B为较浓的溶 液，入射光被液池前部的荧光体剧烈吸收后而发 生较强的荧光，但在液池中、后部分的荧光体， 生较强的荧光，但在液池中、后部分的荧光体， 则因入射光强度大大减弱而使所产生的荧光强度 大大下降。 大大下降。因而在检测器窗口所探测到的荧光强 度反而更低。 度反而更低。
8
内滤效应示意图
I0
It
I0
It
F 图A
F 返回 图B
9
⑵ 激发态分子与基态分子或其它溶质分子 形成复合物， 形成复合物，甚至产生荧光物质基态分子的 聚集体 在浓度较高的溶液中，可能发生溶质与 在浓度较高的溶液中， 溶质间的相互作用， 溶质间的相互作用，产生荧光物质的激发态 分子与其基态分子的复合物或荧光物质的激 发态分子与其它溶质基态分子的复合物 复合物， 发态分子与其它溶质基态分子的复合物，从 而导致荧光强度的下降。在浓度更大时，甚 而导致荧光强度的下降。在浓度更大时， 至可能产生荧光物质基态分子的聚集体 聚集体， 至可能产生荧光物质基态分子的聚集体，导 致荧光强度更严重的下降。 致荧光强度更严重的下降。
第六章荧光分光光度法
公式成立前提条件：εbc=A<0.05
即：当试样浓度较低时（c<0.05/εb），C与F方成 线性。（如果浓度过高，分子碰撞机会增大，而产生 无辐射去激活，造成线性偏离。）
第三节 荧光分光光度计
一、基本结构示意图
样品池
光源 激发光单色器
荧光单色器
特点：1 ．光源方向与检测方向成直角； 2 ．二个单色器。
二、问答题
试述分子荧光产生的过程。 试述分子荧光强度与浓度的关系式，并 说明公式成立的前提条件及原因。 分别说明荧光分光光度计两个单色器的 作用，以及将光路设计成直角方向的原 因。 为什么可见光分光光度计的光路是直线 方向，而荧光分光光度计的光路是直角 方向？
荧光分析的激发光谱和 发射光谱分别提供了哪 些定量分析信息？核黄 素的激发光谱（实线） 和发射光谱（虚线）如 图所示，对核黄素进行 荧光定量分析时，最佳 的激发光波长和荧光波 长各为多少？ 为什么？
激发态 无辐射跃迁 亚稳态（三重态） 荧 光 磷 光 基态
最常见的光致发光：荧光和磷光。
两者发光机理不同，寿命不同。荧光寿命10-9～ 10-6秒，磷光寿命10-3～10秒。 荧光可由激发态的分子产生，也可由激发态的 原子产生，本章介绍分子荧光。 由于荧光的产生由价电子引起，所以，荧光光 谱属于电子光谱，其波长范围位于：紫外光区和可 见光区。
二、激发光谱和发射光谱
⒈ 激发光谱
固定荧光波长，以激发光波长对荧光强度 (F) 所作的光谱曲线。
【例】硫酸奎宁（0.1mol/L硫酸溶液）的激发光谱。
F
300
350
400
λ(nm)
⒉ 发射光谱 固定激发光波长，以荧光波长对荧光强度F 所作的光谱曲线。
荧光分光光度分析法
第一章荧光分光光度分析法1.1概述1.1.1 基本原理由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。
物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态,这些处于激发态的分子是不稳定的，在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光。
不同物质由于分子结构的不同，其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时，其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系，即IF=KC，利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析，与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
1.1.2 基本结构图1 荧光分光光度计工作原理示意图（1）光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。
（2）激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
（3）发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
（4）样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
（5）检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
可将光信号放大并转为电信号。
1.1.3 仪器操作规程1.1.3.1 开机a. 确认所测试样液体或固体，选择相应的附件。
b. 先开启仪器主机电源，预热半小时后启动电脑程序RF-5301PC，仪器自检通过后，即可正常使用。
1.1.3.2 测样（1）spectrum模式a. 在“Acquire Mode”中选择“Spectrum”模式。
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公式成立前提条件：εbc=A<0.05
即：当试样浓度较低时（c<0.05/εb），C与F方成 线性。（如果浓度过高，分子碰撞机会增大，而产生 无辐射去激活，造成线性偏离。）
第三节 荧光分光光度计
一、基本结构示意图
样品池
光源 激发光单色器
荧光单色器
特点：1 ．光源方向与检测方向成直角； 2 ．二个单色器。
检测器
·
显示器
二、主要部件及功能
1．光源
高压汞蒸气灯，氙灯。 能提供紫外光和可见光，光强度比紫外-可见光分光光度 计光源大得多。
2．激发光单色器
作用：提供单波长的激发光。 色散元件：棱镜或光栅。 出射狭缝宽度可调 。
3．样品池
须用石英材料制成。
4．荧光单色器
将样品池中的散射光、反射光、杂质荧光等滤掉，只让荧 光通过。 出射狭缝宽度可调。
核磁波谱法
一、应用：
1.定量分析 能产生荧光 或能形成荧光配合物的物质。 2.简单定性 回答“是不是”。
二、特点：
灵敏度高，比吸收光谱法高10³ 4倍。ppb ~10
选择性比吸收光谱法好。
第二节 基本原理
一、分子荧光的产生 物质吸收光辐射 价电子从基态跃到激发态，然 后再回到基态 释放能量⒈以热能的形式。⒉以光辐 射的形式。以光辐射形式释放能量时，发射荧光。这 种现象称为光致发光。
第六章 荧光分光光度法
基本要求： 了解荧光光谱法的基本原理和应用 特点。了解荧光分光光度计的组成以及 特点。掌握荧光光谱法的定量分析方法。 了解影响荧光强度的因素。
第一节 概论
回顾： 电化学分析法 四大类 光学分析法 色谱分析法 其它分析方法
原子光谱法
分子光谱法 X射线光谱法
紫外-可见光分光光度法 荧光分光光度法 红外吸收光谱法 拉曼光谱法
λ(nm)
三、分子荧光与分子结构的关系
分子要产生荧光，首先要能吸收紫外光或可见光。
能产生荧光的分子具有的结构特点：
共轭双键 刚性平面 多环结构
C H2
【例】
芴具有刚性平面，产生的荧光比联二苯强。
四、荧光强度与浓度的关系
F=2.303ΦI0εbc
Φ：量子效率，发射光量子与吸收光量子之比。 I0：入射光强度 ε：摩尔吸光系数 b： 光程 c：浓度
激发态 无辐射跃迁 亚稳态（三重态） 荧 光 磷 光 基态
最常见的光致发光：荧光和磷光。
两者发光机理不同，寿命不同。荧光寿命10-9～ 10-6秒，磷光寿命10-3～10秒。 荧光可由激发态的分子产生，也可由激发态的 原子产生，本章介绍分子荧光。 由于荧光的产生由价电子引起，所以，荧光光 谱属于电子光谱，其波长范围位于：紫外光区和可 见光区。
所以，有时需要pH缓冲液控制pH值在适当范围内。
4．溶剂 有些溶剂会使荧光效率下降，也可能带来干扰荧光。
三、定量分析的特点及应用
灵敏度高。可高达ppb级（10-9），甚至ppt 级（10-12）。 选择性好，与能产生荧光的物质少有关。
思考题
一、概念 （荧光）激发光谱 （荧光）发射光谱
二、激发光谱和发射光谱
⒈ 激发光谱
固定荧光波长，以激发光波长对荧光强度(F) 所作的光谱曲线。
【例】硫酸奎宁（0.1mol/L硫酸溶液）的激发光谱。
F
300
350
400
λ(nm)
⒉ 发射光谱 固定激发光波长，以荧光波长对荧光强度F 所作的光谱曲线。
【例】蒽（乙醇溶液）的发射光谱。
F
300
350
400
二、影响荧光强度测定的因素
1．激发光照射 有一些荧光物质若受到强光照射，会发生分解而导致F↓。 所以，荧光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在 测定时才打开光闸让激发光照射样品池。 2．温度 温度↑，荧光效率下降，F↓。（因为，温度↑，增加分子间 碰撞机会而使能量消耗掉。）
3．pH值
pH值能改变某些荧光物质的电子构型从而影响荧光强度。 【例】 苯胺 pH7～12时，发兰色荧光。 pH﹤2或PH﹥13时，无荧光的过程。 试述分子荧光强度与浓度的关系式，并 说明公式成立的前提条件及原因。 分别说明荧光分光光度计两个单色器的 作用，以及将光路设计成直角方向的原 因。 为什么可见光分光光度计的光路是直线 方向，而荧光分光光度计的光路是直角 方向？
荧光分析的激发光谱和 发射光谱分别提供了哪 些定量分析信息？核黄 素的激发光谱（实线） 和发射光谱（虚线）如 图所示，对核黄素进行 荧光定量分析时，最佳 的激发光波长和荧光波 长各为多少？ 为什么？
5．检测器
光电转换元件，测定荧光的强度。 检测方向与激发光方向垂直：在垂直方向上没有透过光的 干扰。 由于荧光的强度较弱，一般以光电倍增管作检测器。
第四节 定量分析
一、定量方法
一般采用工作直线法。作C—F直线。
F
C
⑴配制一系列待测成分的标准溶液 C1 C2 C3 C4 C5 ⑵测出相应的荧光强度 F1 F2 F3 F4 F5 ⑶建立工作直线（ F →C） ①作图法 ②回归法 ⑷测量待测样品，得F样 ①从工作直线上找到待测成分的浓度C样 ②由回归方程计算出C样