高温蛋白酶产生菌的筛选及其产酶条件和酶学性质分析
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状。测定 了 菌 株 L7 的 16S rRNA 基 因 序 列 长 度 1 063 bp，将结果提交 GenBank，序列号为 HM011262。 将序列用 ClustalX 1． 8． 3 进行多重序列对比，用软 件 MEGA3． 0 按 Neighbor-joining 法以 16S rRNA 同 源性为基础，构建了包括 15 株相关种属的细菌系统 发育树（ 图 1 ） 。分 离 菌 株 L7 与 嗜 热 短 芽 孢 杆 菌 （ Brevibacillus thermoruber） 在同一分支，两者序列相 似性超过 99% 。
本研究从温泉样品中筛选得到一株活性较高
的产高温蛋白酶的高温短芽孢杆菌，命名为 Brevibacillus sp． strain L7，对 其 产 酶 条 件 及 一 些 酶 性 质 进行研究。
1 材料与方法
1． 1 材料 采集土壤来自徂徕山温泉周围。在温泉周围
16 个方位采集土样，－ 20℃ 冷冻保存［7］。 1． 2 主要培养基
廉立慧等： 高温蛋白酶产生菌的筛选及其产酶条件和酶学性质分析
177
在同样条件下，再以钙离子为金属离子的基础发酵 培养基，55℃ ，200 r / min 的条件下，发酵 24 h，产酶 活力最大，酶活为 35． 680 U / mL。
表 3 氮源对产酶影响
氮源 酪素 蛋白胨 玉米粉 黄豆粉 牛肉膏
酶活（ U / mL） 10． 868 36． 360 23． 588 32． 78 14． 472
表 2 碳源对产酶影响
碳源
酶活（ U / mL）
可溶性淀粉
19． 656
葡萄糖
38． 080
蔗糖
4． 800
玉米粉
9． 908
麦芽糖
10． 300
2． 3． 2 氮源对产酶活力的影响 取种子液分别接 种到以酪素、蛋白胨、玉米粉、黄豆粉、牛肉膏为氮源 的基础发酵培养基，比较产酶活力，结果如表 3。由 表 3 可以看到，在以葡萄糖唯一碳源，55℃ ，200 r / min，发酵 24 h 条件下，以蛋白胨作为唯一氮源的 L7 产蛋白酶能力高于其他 4 组氮源对照组，酶活力为 36． 360 U / mL。 2． 3． 3 金属离子对产酶活力的影响 取种子液分 别接种到 3 种含有不同金属离子的基础发酵培养 基，比较产酶活力，结果如表 4。由表 4 可以看出，
将采样来的土 壤 用 无 菌 水 配 成 1 ∶ 10 （ g /L） ， 55℃ ，110 r / min 摇瓶温育过夜。将温育好的土壤 悬液静置，上清液用 55℃ 恒温好的无菌水依次从 10 倍稀释至 105 倍。涂布在倒置的平板上，于 55℃ 培养。 1． 3． 1 初筛 挑取分离平板上高温菌菌落，接种于 固体选择培养基上，在 55℃ 条件下恒温培养 48 h， 菌落周围有透明圈的即为产高温蛋白酶菌，挑取透 明圈较大的作为初筛菌株。 1． 3． 2 复筛 将初筛得到的菌株接种于发酵培养基 中进行复筛。在 55℃ ，200 r / min 的条件下，振荡培养 48 h 后，离心后取上清进行蛋白酶活力的测定。 1． 4 酶活力测定
图 1 以 L7 菌株 16S rRNA 序列为基础的系统发育树
淀粉、葡萄糖、蔗糖、玉米粉和 麦 芽 糖 为 碳 源 的 基 础 发酵培养基，比较 发 酵 酶 活 力，结 果 如 表 2。由 表 2 可以看到，以蛋白胨作为唯一氮源的基础发酵培 养基，在 55℃ ，200 r / min 的条件下发酵 24 h，葡萄 糖 作 为 唯 一 碳 源 的 条 件 下 ，菌 株 产 酶 活 力 最 大 ，为 38. 080 U /mL。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2011 年第 3 期
g，氯化锰 0. 05 g，硫酸锌 0. 03 g，硫酸铜 0. 02 g，钼酸 钠 0. 015 g，硫酸钒 0. 02 g，硫酸镍 0. 02 g，氯化镁 0. 03 g，硫酸铁 0. 02 g，琼脂 20 g，pH7. 0。选择培养基（ 1 L） ： 蛋白胨 10 g，葡萄糖 1 g，氯化钠 5 g，氯化钙 0. 1 g，酪氨酸 0. 1 g，酪素 5 g，琼脂 22 g，pH7. 0。种子培 养基 （ 1 L） ： 蛋 白 胨 10 g，酵 母 粉 5 g，NaCl 10 g， pH7. 0。基础发酵培养基（ 1 L） ： 葡萄糖40 g，蛋白胨 20 g，磷酸氢二 钠 1. 4 g，氯 化 钙 0. 6 g，硫 酸 镁 0. 4 g，pH7. 0 1. 3 菌株的分离
分离培养基（ 1 L） ： 酵母膏 1 g，蛋白胨 2 g，硫 酸铵 3 g，硫酸钾 0. 5 g，氯化钾 0. 1 g，甘氨酸 0. 7
收稿日期： 2010-08-24 基金项目： 泰山医学院青年基金项目 作者简介： 廉立慧，女，硕士，讲师，研究方向： 微生物学； E-mail： lianlihui@ yahoo． com． cn
关键词： 短芽孢杆菌 高温蛋白酶 发酵条件 酶学性质
Screening of Thermostable Protease-producing Bacterium and Analysis of Fermentation Conditions and Protease Properties
Lian Lihui Gao Lijun Wang Decai Zhang Xianzhong Li Yanling
Key words： Brevibacillus sp． Thermophilic protease Fermentation condition Enzymatic properties
蛋白酶作为一类广泛用于工业生产和研究用 酶，在洗涤剂、制革脱毛、生丝脱胶、有机合成、酒类 澄清、明胶及蛋白胨生产、肉质嫩化和医药等方面应 用广泛，占酶制剂市场 65% 的份额［1］。高温蛋白酶 具有耐热、耐变性剂和耐有机溶剂等优点，在蛋白酶 应用的各个领域显示出极大的潜力［2］。20 世纪 50、 60 年代，国外学者已开始了高温菌产高温蛋白酶的 研究，至 今 有 许 多 这 方 面 的 报 道［3，4］。 国 内 对 高 温 菌的研究起步较晚，所筛选到的菌株产高温蛋白酶 的能力也不高［5，6］。
置信度检测，自举数据集为 1 000 次。
2 结果与分析
2． 1 菌种的筛选 用稀释平板法从土壤中分离得到 154 株菌，点
种于酪蛋白底物平板，筛选到 63 株有较大水解圈的 产高温蛋白酶的菌株。随机挑选 9 株产蛋白酶高温 菌株测得酶活如表 1。由表 1 可见，筛选到的大部 分高温细菌属于芽孢杆菌。确定一株产酶稳定，且 其产物高温蛋白酶具有较高活性的菌株 L7 作为出 发菌株。
采用 Folin 试剂显色法［8］。pH10． 0，55℃ 条件 下，每分钟水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需酶量定 义为一个酶活力单位（ U） 。 1． 5 扩增 16S rRNA 与系统进化分析
根据 Lane（ 1991） 扩增的上游引物（ GGTTACCTTGTTACGACTT） 和 下 游 引 物 （ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG） 使用 PCR 仪扩增 16S rRNA，PCR 反应程 序： 94℃ 预变性 5 min，95℃ 变性 40 s，50℃ 退 火 1 min，72℃ 延伸 2 min，共循环 30 次； 然后 72℃ 保持 10 min。用凝胶回收纯化试剂盒回收扩增到的目的 片段，连接到 pMD18-T 载 体 上，挑 取 转 化 子 测 序。 测序由上海桑尼生物科技有限公司完成。将菌株的 16S rRNA 基因序列与从 GenBank 数据库中获得的 短芽孢杆菌属和其他相关属细菌的 16S rRNA 基因 序列，用系统发生推断软件包 MEGA3． 0 进行统计 和聚类分析。采用邻接法（ neighbor-joining method） 获得分支系统树，并通过自举分析（ bootstrap） 进行
（ Department of Biological Sciences，Taishan Medical College，Taian 271000）
Abstract： Nine thermophilic bacterial strains with thermophilic protease activity were collected from the soil around a hot spring in Mountain Culai． The strain which showed high protease activity was selected for protease assay and named as L7． Based on morphological characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis，strain L7 was identified as Brevibacillus sp． ． The optimal medium components were glucose 40 g / L，peptone 20 g / L，Na2 HPO4 1． 4 g / L，CaCl2 0． 6 g / L，MgCl2 0． 4 g / L． The protease activity can achieve 103． 08 U / mL through the medium optimization． The optimal culture conditions were 50 mL medium in 250 mL Erlenmeyer flask，initial pH8． 0，at 55℃ for 24 h． Enzymatic properties showed that the enzyme optimal temperature is 55℃ ，optimum pH10. 0． The enzyme exhibited high thermal stability and stable at a wide range of pH，and its activity is intensively const rained by PMSF．
根据 16S rRNA 同源性比较，结合菌株的形态 学观察，可基本将分离的菌株归属为短芽孢杆菌，命 名为 Brevibacillus sp． strain L7。 2． 3 产酶条件 2． 3． 1 碳源对产酶活力的影响 改变基础发酵培 养基中碳源的种类。取种子液分别接种到以可溶性
2011 年第 3 期
·研究报告·
生来自百度文库技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2011 年第 3 期
高温蛋白酶产生菌的筛选及其产酶条件和酶学性质分析
廉立慧 高丽君 王德才 张显忠 李艳玲
（ 泰山医学院生物科学系，泰安 271000）
摘 要： 从徂徕山温泉附近土样中分离到 9 株产高温蛋白酶菌株，选取一株碱性蛋白酶高产菌株 L7 为出发菌株，进行 显微形态、16S rRNA 基因序列分析，将其初步鉴定为短芽孢杆菌（ Brevibacillus sp． ） 。研究该菌株发酵条件，确定产酶的最佳 培养基组成为葡萄糖 40 g / L，蛋白胨 20 g / L，磷酸氢二钠 1． 4 g / L，氯化钙 0． 6 g / L，硫酸镁 0． 4 g / L，通过培养基优化，酶活达到 103． 08 U / mL。最佳培养条件为 250 mL 三角烧瓶中装液量 50 mL、pH8． 0、培养温度为 55℃ 、培养时间为 24 h。对该菌株酶学 性质研究，L7 菌株所产高温蛋白酶的最适温度为 55℃ ，最适 pH 为 10，并且具有良好的温度稳定性和 pH 稳定性，酶活性受 PMSF 强烈抑制。
表 1 九株产蛋白酶高温菌株酶活力与芽孢染色
菌株编号
蛋白酶活力（ U / mL）
芽孢染色
L1
4． 514
有芽孢
L2
12． 787
有芽孢
L3
8． 743
有芽孢
L4
4． 374
有芽孢
L5
8． 779
有芽孢
L6
4． 783
有芽孢
L7
28． 896
有芽孢
L8
12． 189
有芽孢
L9
8． 590
无芽孢
2． 2 菌株鉴定结果 菌株 L7 为革兰氏染色反应为阳性，菌体呈短杆
本研究从温泉样品中筛选得到一株活性较高
的产高温蛋白酶的高温短芽孢杆菌，命名为 Brevibacillus sp． strain L7，对 其 产 酶 条 件 及 一 些 酶 性 质 进行研究。
1 材料与方法
1． 1 材料 采集土壤来自徂徕山温泉周围。在温泉周围
16 个方位采集土样，－ 20℃ 冷冻保存［7］。 1． 2 主要培养基
廉立慧等： 高温蛋白酶产生菌的筛选及其产酶条件和酶学性质分析
177
在同样条件下，再以钙离子为金属离子的基础发酵 培养基，55℃ ，200 r / min 的条件下，发酵 24 h，产酶 活力最大，酶活为 35． 680 U / mL。
表 3 氮源对产酶影响
氮源 酪素 蛋白胨 玉米粉 黄豆粉 牛肉膏
酶活（ U / mL） 10． 868 36． 360 23． 588 32． 78 14． 472
表 2 碳源对产酶影响
碳源
酶活（ U / mL）
可溶性淀粉
19． 656
葡萄糖
38． 080
蔗糖
4． 800
玉米粉
9． 908
麦芽糖
10． 300
2． 3． 2 氮源对产酶活力的影响 取种子液分别接 种到以酪素、蛋白胨、玉米粉、黄豆粉、牛肉膏为氮源 的基础发酵培养基，比较产酶活力，结果如表 3。由 表 3 可以看到，在以葡萄糖唯一碳源，55℃ ，200 r / min，发酵 24 h 条件下，以蛋白胨作为唯一氮源的 L7 产蛋白酶能力高于其他 4 组氮源对照组，酶活力为 36． 360 U / mL。 2． 3． 3 金属离子对产酶活力的影响 取种子液分 别接种到 3 种含有不同金属离子的基础发酵培养 基，比较产酶活力，结果如表 4。由表 4 可以看出，
将采样来的土 壤 用 无 菌 水 配 成 1 ∶ 10 （ g /L） ， 55℃ ，110 r / min 摇瓶温育过夜。将温育好的土壤 悬液静置，上清液用 55℃ 恒温好的无菌水依次从 10 倍稀释至 105 倍。涂布在倒置的平板上，于 55℃ 培养。 1． 3． 1 初筛 挑取分离平板上高温菌菌落，接种于 固体选择培养基上，在 55℃ 条件下恒温培养 48 h， 菌落周围有透明圈的即为产高温蛋白酶菌，挑取透 明圈较大的作为初筛菌株。 1． 3． 2 复筛 将初筛得到的菌株接种于发酵培养基 中进行复筛。在 55℃ ，200 r / min 的条件下，振荡培养 48 h 后，离心后取上清进行蛋白酶活力的测定。 1． 4 酶活力测定
图 1 以 L7 菌株 16S rRNA 序列为基础的系统发育树
淀粉、葡萄糖、蔗糖、玉米粉和 麦 芽 糖 为 碳 源 的 基 础 发酵培养基，比较 发 酵 酶 活 力，结 果 如 表 2。由 表 2 可以看到，以蛋白胨作为唯一氮源的基础发酵培 养基，在 55℃ ，200 r / min 的条件下发酵 24 h，葡萄 糖 作 为 唯 一 碳 源 的 条 件 下 ，菌 株 产 酶 活 力 最 大 ，为 38. 080 U /mL。
176
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2011 年第 3 期
g，氯化锰 0. 05 g，硫酸锌 0. 03 g，硫酸铜 0. 02 g，钼酸 钠 0. 015 g，硫酸钒 0. 02 g，硫酸镍 0. 02 g，氯化镁 0. 03 g，硫酸铁 0. 02 g，琼脂 20 g，pH7. 0。选择培养基（ 1 L） ： 蛋白胨 10 g，葡萄糖 1 g，氯化钠 5 g，氯化钙 0. 1 g，酪氨酸 0. 1 g，酪素 5 g，琼脂 22 g，pH7. 0。种子培 养基 （ 1 L） ： 蛋 白 胨 10 g，酵 母 粉 5 g，NaCl 10 g， pH7. 0。基础发酵培养基（ 1 L） ： 葡萄糖40 g，蛋白胨 20 g，磷酸氢二 钠 1. 4 g，氯 化 钙 0. 6 g，硫 酸 镁 0. 4 g，pH7. 0 1. 3 菌株的分离
分离培养基（ 1 L） ： 酵母膏 1 g，蛋白胨 2 g，硫 酸铵 3 g，硫酸钾 0. 5 g，氯化钾 0. 1 g，甘氨酸 0. 7
收稿日期： 2010-08-24 基金项目： 泰山医学院青年基金项目 作者简介： 廉立慧，女，硕士，讲师，研究方向： 微生物学； E-mail： lianlihui@ yahoo． com． cn
关键词： 短芽孢杆菌 高温蛋白酶 发酵条件 酶学性质
Screening of Thermostable Protease-producing Bacterium and Analysis of Fermentation Conditions and Protease Properties
Lian Lihui Gao Lijun Wang Decai Zhang Xianzhong Li Yanling
Key words： Brevibacillus sp． Thermophilic protease Fermentation condition Enzymatic properties
蛋白酶作为一类广泛用于工业生产和研究用 酶，在洗涤剂、制革脱毛、生丝脱胶、有机合成、酒类 澄清、明胶及蛋白胨生产、肉质嫩化和医药等方面应 用广泛，占酶制剂市场 65% 的份额［1］。高温蛋白酶 具有耐热、耐变性剂和耐有机溶剂等优点，在蛋白酶 应用的各个领域显示出极大的潜力［2］。20 世纪 50、 60 年代，国外学者已开始了高温菌产高温蛋白酶的 研究，至 今 有 许 多 这 方 面 的 报 道［3，4］。 国 内 对 高 温 菌的研究起步较晚，所筛选到的菌株产高温蛋白酶 的能力也不高［5，6］。
置信度检测，自举数据集为 1 000 次。
2 结果与分析
2． 1 菌种的筛选 用稀释平板法从土壤中分离得到 154 株菌，点
种于酪蛋白底物平板，筛选到 63 株有较大水解圈的 产高温蛋白酶的菌株。随机挑选 9 株产蛋白酶高温 菌株测得酶活如表 1。由表 1 可见，筛选到的大部 分高温细菌属于芽孢杆菌。确定一株产酶稳定，且 其产物高温蛋白酶具有较高活性的菌株 L7 作为出 发菌株。
采用 Folin 试剂显色法［8］。pH10． 0，55℃ 条件 下，每分钟水解酪蛋白产生 1 μg 酪氨酸所需酶量定 义为一个酶活力单位（ U） 。 1． 5 扩增 16S rRNA 与系统进化分析
根据 Lane（ 1991） 扩增的上游引物（ GGTTACCTTGTTACGACTT） 和 下 游 引 物 （ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG） 使用 PCR 仪扩增 16S rRNA，PCR 反应程 序： 94℃ 预变性 5 min，95℃ 变性 40 s，50℃ 退 火 1 min，72℃ 延伸 2 min，共循环 30 次； 然后 72℃ 保持 10 min。用凝胶回收纯化试剂盒回收扩增到的目的 片段，连接到 pMD18-T 载 体 上，挑 取 转 化 子 测 序。 测序由上海桑尼生物科技有限公司完成。将菌株的 16S rRNA 基因序列与从 GenBank 数据库中获得的 短芽孢杆菌属和其他相关属细菌的 16S rRNA 基因 序列，用系统发生推断软件包 MEGA3． 0 进行统计 和聚类分析。采用邻接法（ neighbor-joining method） 获得分支系统树，并通过自举分析（ bootstrap） 进行
（ Department of Biological Sciences，Taishan Medical College，Taian 271000）
Abstract： Nine thermophilic bacterial strains with thermophilic protease activity were collected from the soil around a hot spring in Mountain Culai． The strain which showed high protease activity was selected for protease assay and named as L7． Based on morphological characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis，strain L7 was identified as Brevibacillus sp． ． The optimal medium components were glucose 40 g / L，peptone 20 g / L，Na2 HPO4 1． 4 g / L，CaCl2 0． 6 g / L，MgCl2 0． 4 g / L． The protease activity can achieve 103． 08 U / mL through the medium optimization． The optimal culture conditions were 50 mL medium in 250 mL Erlenmeyer flask，initial pH8． 0，at 55℃ for 24 h． Enzymatic properties showed that the enzyme optimal temperature is 55℃ ，optimum pH10. 0． The enzyme exhibited high thermal stability and stable at a wide range of pH，and its activity is intensively const rained by PMSF．
根据 16S rRNA 同源性比较，结合菌株的形态 学观察，可基本将分离的菌株归属为短芽孢杆菌，命 名为 Brevibacillus sp． strain L7。 2． 3 产酶条件 2． 3． 1 碳源对产酶活力的影响 改变基础发酵培 养基中碳源的种类。取种子液分别接种到以可溶性
2011 年第 3 期
·研究报告·
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BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2011 年第 3 期
高温蛋白酶产生菌的筛选及其产酶条件和酶学性质分析
廉立慧 高丽君 王德才 张显忠 李艳玲
（ 泰山医学院生物科学系，泰安 271000）
摘 要： 从徂徕山温泉附近土样中分离到 9 株产高温蛋白酶菌株，选取一株碱性蛋白酶高产菌株 L7 为出发菌株，进行 显微形态、16S rRNA 基因序列分析，将其初步鉴定为短芽孢杆菌（ Brevibacillus sp． ） 。研究该菌株发酵条件，确定产酶的最佳 培养基组成为葡萄糖 40 g / L，蛋白胨 20 g / L，磷酸氢二钠 1． 4 g / L，氯化钙 0． 6 g / L，硫酸镁 0． 4 g / L，通过培养基优化，酶活达到 103． 08 U / mL。最佳培养条件为 250 mL 三角烧瓶中装液量 50 mL、pH8． 0、培养温度为 55℃ 、培养时间为 24 h。对该菌株酶学 性质研究，L7 菌株所产高温蛋白酶的最适温度为 55℃ ，最适 pH 为 10，并且具有良好的温度稳定性和 pH 稳定性，酶活性受 PMSF 强烈抑制。
表 1 九株产蛋白酶高温菌株酶活力与芽孢染色
菌株编号
蛋白酶活力（ U / mL）
芽孢染色
L1
4． 514
有芽孢
L2
12． 787
有芽孢
L3
8． 743
有芽孢
L4
4． 374
有芽孢
L5
8． 779
有芽孢
L6
4． 783
有芽孢
L7
28． 896
有芽孢
L8
12． 189
有芽孢
L9
8． 590
无芽孢
2． 2 菌株鉴定结果 菌株 L7 为革兰氏染色反应为阳性，菌体呈短杆