土壤溶菌酶提取的实验报告

学术活动实验报告

题目：土壤中溶菌酶的筛选与发酵指导老师：

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目录

摘要 (1)

一：实验目的 (1)

二：实验原理 (1)

2.1什么是溶菌酶 (1)

2.2溶菌酶的应用 (2)

2.3实验指示菌 (3)

三：实验内容 (3)

3.1 实验器材 (3)

3.2 实验步骤 (4)

四：实验结果记录 (8)

五：实验心得体会 (9)

摘要：土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物的主要菌源。通过采用无菌操作技术，先用稀释法制备土壤的菌悬液，然后结合选择培养基用平板划线法分离出溶菌酶，通过观察和描述培养特征对菌株所属类群进行初步鉴定，对溶菌酶进行发酵。

关键词：土壤溶菌酶分离纯化细菌无菌

一、实验目的

1.掌握溶菌酶的生长特性以及培养方法。

2.掌握溶菌酶实验的基本生物技术，主要包括无菌操作技术、

纯种分离技术、纯种培养技术。

3.掌握合成培养基并选择培养基的制备方法。

4.学习对微生物实验的中出现问题的分析解决方法。

二、实验原理

2.1什么是溶菌酶

溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

溶菌酶存在于人体的各个组织中，如心、脏、脾、肺和肾等，

其中以肾和肺中含量最高。鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。植物中有溶菌酶，目前已从木瓜、无花果、芜菁、大麦等植物中分离出溶菌酶，其分子量较大，约为24000～29100。

溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性。蛋清溶菌酶是C 型，是已知的最耐热的酶。溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移到水溶液中时，溶菌酶的活力可全部恢复。溶菌酶可被冷冻或干燥处理，且活力稳定。溶菌酶适宜pH5.3~6.4，可用于低酸性食品防腐。溶菌酶的抗菌谱较广，不仅局限于G+ 菌，对部分G­ 菌也有抑制效果。溶菌酶作为防腐剂安全性高。溶菌酶是一种天然蛋白质，1992年FAO/WTO 的食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的。

2.2溶菌酶的应用

2.2.1医学应用

可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。口服和肌注均有效。口服，3～5片/次(肠溶片含10mg)，3次/日。口含，1片/次(口含片含20mg)，4～6次/日。外用：以1%～2%溶液滴注、涂擦或直接喷粉。肌注，50mg～100mg/次，1～2次/日。滴眼：用2%溶液。

2.2.2食品和发酵工业

溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳

化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。此外，还能利用溶菌酶生产酵母浸膏和核酸类调味料等。

2.2.3 副作用

偶有较轻的过敏反应。氯化溶菌酶医疗效果更广，有浓痰分散、出血抑制、组织修复、消炎镇痛、抗过滤性病毒等作用，因而用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感冒、皮肤病及眼、鼻、喉等用药。

2.2.4细胞工程

溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理细菌可得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。

2.3实验指示菌

金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus ) 是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。所以在实验过程中一定要严谨，不要污染实验环境。

三、实验内容

3.1 实验器材

1.器材：培养皿、载玻片、量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角

瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、镊子、恒温培养箱、高温灭菌锅、无菌操作台、天平、滤纸、pH试纸等。

2.试剂：

指示菌培养基:Luria-Bertani(LB)培养基，蛋白胨1%，酵母膏

0.5%，NaCl 1%，pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。

初筛培养基及菌株的保存培养基: 蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 1%，琼脂 1.5%-2%。pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌

20min。

基础培养基: 蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl 1%。pH值调至

7.2-7.4，121℃灭菌20min。

摇瓶发酵产酶培养基:可溶性淀粉 1.25%，牛肉膏2.5%，玉米浆1%，Tween 0.1%，pH值调至7.0，121℃灭菌 20min。

土壤稀液：5g土壤研磨，加10g无菌水，梯度稀释10-6 倍。（梯度稀释：取1ml 原液加入9 ml无菌水，反复五次，即为10-6 倍）3.2 实验步骤

步骤一：

1.土壤的稀释：

①研磨土壤，量取5g土壤加入锥形瓶中贴标签；

②加入50mL的水用报纸封口；

③土壤溶液放入恒温振荡器中震荡20分钟；

④取5个试管，分别加入900µL的水；

⑤从锥形瓶的土壤溶液中吸取100µL的溶液滴入第一个试管中，

反复吸放几次使溶液均匀；

⑥换枪头从第一个试管中吸100µL的溶液至第二个试管中；

⑦反复吸上吸下几次，使溶液均匀再换枪头吸100µL入第三个试

管中；

⑧如此直至到第五个试管,然后给第五个管贴标签即为106 的土壤

稀释液;

2.初筛培养基的配置（三组共作200mL）：

①取一个大锥形瓶，用电子称称量2.08g蛋白胨放入大锥形瓶