第十章 转基因植物的检测与鉴定

第二节 外源基因整合的Southern杂交鉴定

Southern杂交是以DNA或RNA为探针，检查DNA链，用于 外源基因整合的鉴定及分析。
具有灵敏度高（可检出1pgDNA样品）；特异性强（可 鉴别出20个碱基对左右的同源序列）的特点 根据杂交时所用的具体方法分为：印迹杂交、斑点或 狭缝杂交和细胞原位杂交等。
第三节 外源基因转录的Northern杂交检测

植物细胞总RNA的提取 探针的制备 印迹及杂交
外源基因表达的RT-PCR检测
第四节 外源基因表达蛋白的检测

外源基因表达蛋白检测主要利用免疫学原理， 主要方法是Western杂交和ELISA 酶联免疫吸附法（ELISA）是一种利用免疫学 原理检查抗原、抗体的技术。 检测程序包括：抗体制备、抗体或抗原的包被 和免疫反应及检出。

抗生物素蛋白可与酶、荧光素等物质结合，是抗生物 素蛋白被这些物质标记，杂交时，生物素标记探针与 被检的单链DNA中同源序列杂交，检出时，加入被酶等 标记物标记的抗生物素蛋白，生物素与被标记的抗生 物素蛋白特异结合，形成杂交DNA-生物素-抗生物素酶等标记物的杂交检出体系，根据抗生物素蛋白上的 标记物性质进行检出。
一、ELISA检测


1、抗体的制备

抗体：是机体应抗原刺激产生的一组特殊的 球蛋白，Ig表示。

ELISA检测中涉及的抗体有两种，未标记的抗 体和酶标记的抗体，酶标记的抗体有包括两 种：一是针对特异抗原的酶标一抗，一是针 对一抗的酶标二抗。
2、包被

包被是将抗原或抗体固定在固相载体表面。常
用的固相载体是多孔的聚苯乙烯微量反应板。

操作：将印迹后的固相膜放在含封闭剂的预杂交液中， 37-42 ℃温育3-12h

洗膜：是杂交后将固相膜依次置于不浓度的溶 液中漂洗，以除去游离的及非特异性位点上结 合的探针。 洗膜液的温度、离子强度及洗膜时间是影响洗 膜效果的三要素。

6、杂交信号的检出

放射性标记的探针通过放射自显影检出； 包括：感光材料曝光、显影、定影、水洗等 过程。 非放射性标记的探针主要通过酶反应法检出 包括：偶联反应和酶的显色反应两阶段。
单体蛋白，分子量26888Da，它在蓝光激发下能发出绿 光。
Gfp作报告基因的优点：

适用于各种生物的基因转化； 检查方法简便，无需底物、梅、辅因子等物质； 便于活体检测； 检测是可获得直观信息。
2、gus（β -葡萄糖苷酸酶）基因

Gus基因存在于某些细菌体内，是一种水解酶，能催化 许多β -葡萄糖苷酯类物质的水解。 检测方法：组织化学染色定位法 以X-Gluc为底物，通过显色反应可直接观察到组织器 官中gus基因的活性。在适宜的条件下，该酶可将XGluc水解成蓝色物质，此靛蓝染料使具有Gus活性的部 位或位点呈现蓝色，用肉眼或显微镜即可观察。
1、探针核苷酸序列的获取

鉴定转基因植株时应使用同源探针，常以转化的目 的基因作探针。 目的基因探针一般从载体质粒上切取。包括质粒DNA 的分离纯化；限制性内切梅切割；电泳分离酶切片 段；从凝胶中回收wenku.baidu.com的片段。

2、探针标记
（1）理想的标记物条件：

标记前后探针的基本结构相同，标记物不影响探针 的杂交特异性； 检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好且操 作简便、省时；

28-4切口平移法
28-5随机引物法
三、Southern印迹杂交
程序 1、植物总DNA的限制酶切 2、凝胶电泳分离酶切片段 3、凝胶中的DNA变性 4、印迹：毛细转移法和电转移法 5、杂交 6、杂交信号的检出
5、杂交
1）杂交体系： 探针浓度：控制在0.5ng/ml或更低 杂交反应温度：低于Tm值15-25℃ 杂交时间：


稳定、安全、无环境污染；
经济。

标记物分为：放射性和非放射性两类 放射性标记物主要有32P、35S、125I、14C等；

非放射性标记物主要有生物素、地高辛、荧光素、 辣根过氧化物酶等.
（2）放射性标记物

制备核酸探针时使用的放射性标记物多为三磷酸核苷 酸（NTP）或脱氧三磷酸核苷酸（dNTP），以这些标记 的核苷酸作底物，通过酶促聚合反应，使标记物掺入 到多核苷酸链中，从而获得合适探针。 特点：放射自显影灵敏度高，压片时间短； 分辨力较低； 探针不能长期保存
3、免疫反应
4、检出
图30-1夹心法示意图
二、Western杂交
Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫 测定融为一体的蛋白质检测方法。 程 序： 植物蛋白质的提取 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 蛋白质条带印迹 探针制备 杂交与检出


目前常使用的报告基因GFP，GUS，BAR，NPTII等
1、gfp（绿色荧光蛋白）基因

简介：绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生物荧 光素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体的、能 在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它是一种能接 受荧光辐射能并最终发射荧光的物质。

从水母中分离纯化的Gfp是由238个氨基酸残基组成的

（3）非放射性标记物

特点：敏感性较差； 稳定性好、分辨力高，检测所需时间短。对人和环境 无害。 生物素:是一种水溶性B族维生素，其分子中的戊酸羧 基经化学修饰可含有各种活性基团，它能与蛋白质、 核酸等多种物质发生偶联，从而使这些物质被生物素 标记。


生物素标记的探针可通过生物素-抗生物素蛋白的亲和 系统检出，也可通过生物素-抗生物素抗体的免疫系统 检出。
第九章
转基因植物的检查与鉴定
第九章

转基因植物的检查与鉴定
第一节 报告基因的表达检测 第二节 外源基因整合的Southern杂交鉴定


第三节 外源基因转录的Northern杂交检测
第四节 外源基因表达蛋白的检℃测
第一节 报告基因的表达检测
报告基因的两大特点：

表达产物及产物的类似功能在未转化的植 物细胞内并不存在； 便于检查



分子杂交涉及三大内容：制备杂交探针；制备被检的 核酸或蛋白质样品；印迹及杂交。
一、Southern杂交步骤
（一）植物总DNA提取
（二）杂交探针的制备

探针：是经过特殊化合物标记的特定的核苷酸序列。 分为DNA探针和RNA探针，DNA探针又分为单链DNA探针 和双链DNA探针。

杂交探针制备包括：探针核苷酸序列的获取及标记两 部分。

二、外源基因整合的PCR-Southern检测

该方法是先对被检测材料进行外源基因的PCR扩增， 然后再用目的基因的同源探针与扩增的特异性条带 进行杂交。 注意：设置三个对照 空白对照：无任何DNA模板；

阳性对照：以外源基因的重组质粒DNA为模板；
阴性对照：以非转化植株基因组DNA为模板。
图28-3地高辛标记探针杂交体检出原理示意图
3、标记方法

放射性标记有体内标记法及体外标记法。体外 标记法包括化学法、酶法和PCR法

酶法：是先将标记物标记在核苷酸上，然后通
过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸 序列中，产生合适探针。 包括切口平移法及随机引物法。


PCR法：是利用Taq酶可将修饰的核苷酸掺入到 PCR产物中（如32P-dNTP、地高辛-dUTP荧光素 标记的dNTP）所得PCR产物可用作探针。 化学法：是通过标记物的活性基团与核酸分子 中的某种基团发生化学反应而继续标记，标记 物直接与核酸分子相连。
2）预杂交及洗膜

杂交的特异性是影响杂交效果的重要因素，非特异性杂交的去除主 要是通过杂交前的预杂交和杂交后的洗膜完成。


预杂交：是在加入探针前用封闭剂封闭膜上的非特异性 位点。 常用封闭剂包括变性的非特异性DNA，如鲑鱼精子DNA， 小牛胸腺DNA等；另一类是高分子化合物，如Denhardts