实验五转基因植物的检测
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（随机引物，Oligo dT; 特异引物)、 10×One Step RNA PCR Buffer、25 mM MgCl2、10 mM
dNTP、RNase Inhibitor (40 U/μl)、AMVOptimized Taq1 μl、AMV RTase XL (5 U/μl)
、上游特异Primer (20 μM)*1、下游特异 Primer (20 μM)*2、RNase Free H2O。
实验操作步骤：
1）RNA提取：
关键 防止RNA降解
RNA提取的成功与否 是RT-PCR检测中最 重要的步骤。
实验步骤
2、cDNA第一链的合成：
取1个0.2ml的PCR管，依次加入下列试剂：
10×PCR Buffer
1 μl
RNase Free dH2O dNTP
5.75 μl 1 μl
RNase Inhibitor
溶菌酶的作用作用?沸水加热的作用? 利用溶菌酶和TritonX-100破坏细胞壁,加热可 使蛋白质和染色体DNA变性.
将实验电泳结果粘到实验报告上，并对结果 分析。
比较三种提取
方法的区别？
实验二、醋酸锂法转化酵母细胞
• 观察并描述培养状况，统计单菌落个数。 • 比较酵母细胞转化与大肠杆菌细胞转化的区别。 • 酵母菌属于真核生物 ,大肠杆菌是细菌属于原核生物 . • 酵母转化在室温，大肠杆菌转化在冰上 • 酵母转化用醋酸锂，大肠杆菌转化用氯化钙 • 酵母转化用穿梭质粒，大肠杆菌转化用普通质粒
30Cycles
目前研究转基因植物外源基因 转录表达的常用方法
1、RT-PCR (RNA)
2、Northern blot (RNA)
3、real-time PCR (RNA ）
结果与分析
• 利用凝胶成像分析仪对电泳结果进行拍照和结果记录； • 观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的
300
400
500
600
头孢唑啉钠 -
-
-
-
-
-
Βιβλιοθήκη Baidu
头孢哌酮钠 -
-
-
-
-
-
头孢曲松钠 -
+
+++
++++
++++
++++
头孢噻肟钠 -
-
++
+++
++++
++++
-：表示无抑制作用；+：表示抑菌圈在8-10mm不透明；++：表示抑菌圈在 10-15mm不透明；+++：表示抑菌圈在15-25mm透明；++++：表示抑菌圈大 于25mm透明；+++++：表示菌板透明，无菌落。
实验目的
1、检测外源基因在植物细胞中的转录，对外 源基因表达调控进行研究，掌握引物的选择 、cDNA的合成、RT-PCR检测的原理与方法。
。
实验材料、设备及试剂
1、材料： 转基因植物的RNA或mRNA制备物。 非转化的植株材料总RNA或mRNA制备物
2、设备：PCR仪、移液器、PCR管等。 3、试剂：10×RT缓冲液、dNTP、逆转录酶、 引物
0.25 μl
AMV RTase Transcriptase
0.5 μl
oligo dT-Adaptor primer
0.5 μl
RNA
1μl
Total
10μl
反应条件：
42 ℃ 30min 99 ℃ 5min 5 ℃ 5min
3、PCR反应
取一个0.2ml的PCR管，依次加入下列试剂：
10×PCR Buffer
4 μl
灭菌蒸馏水
9μl
10 mM dNTP
２.5 μl
Taq酶
0.1 μl
上游特异Primer (20 μM)*1
0.2 μl
下游特异Primer (20 μM)*2
0.2μl
Total
16 μl
将（1）的反应结果稀释20倍，取10 μl 加入到（2）管中，
轻轻摇匀。
反应条件：
94℃ 2min 94 ℃ 30s 55 ℃ 30s 72 ℃ 1min 72 ℃ 7min
电泳谱带分子量和谱带的特异性，确定和描述谱带特征。
RT-PCR扩增得到的810bp的目的基因产物的电泳结果
实验报告
1、将实验结果粘到实验报告上。 2、 如何选择RT-PCR的反转录引物。 3、结合实验结果，试论应用RT-PCR研究外
源基因转录表达的优缺点。
实验一、质粒三种提取方法的比较
为什么要用对数期的菌液提取质粒 ？ 因为对数期菌的 生长状况和数量最佳,有利于提取质粒 溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的作用？ • 溶液Ⅰ 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0 • 葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑 制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并 且可以在后续步骤中被除去 • 溶液Ⅱ 0.2M NaOH / 1% SDS • 破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。 • 溶液Ⅲ 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸 • 这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基 磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分 子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了 ，同时基因组DNA也被PDS共沉淀
• 穿梭质粒是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择
标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载 体。 比如说通常能够在哺乳动物，酵母或者其他细菌复制表 达的质粒，同时可以在大肠杆菌内复制。这样利于对质粒的 分子生物学操作和大量制备。
实验三、侵染菌种对除菌抗生素的敏 感性
头孢酶素 100 200
dNTP、RNase Inhibitor (40 U/μl)、AMVOptimized Taq1 μl、AMV RTase XL (5 U/μl)
、上游特异Primer (20 μM)*1、下游特异 Primer (20 μM)*2、RNase Free H2O。
实验操作步骤：
1）RNA提取：
关键 防止RNA降解
RNA提取的成功与否 是RT-PCR检测中最 重要的步骤。
实验步骤
2、cDNA第一链的合成：
取1个0.2ml的PCR管，依次加入下列试剂：
10×PCR Buffer
1 μl
RNase Free dH2O dNTP
5.75 μl 1 μl
RNase Inhibitor
溶菌酶的作用作用?沸水加热的作用? 利用溶菌酶和TritonX-100破坏细胞壁,加热可 使蛋白质和染色体DNA变性.
将实验电泳结果粘到实验报告上，并对结果 分析。
比较三种提取
方法的区别？
实验二、醋酸锂法转化酵母细胞
• 观察并描述培养状况，统计单菌落个数。 • 比较酵母细胞转化与大肠杆菌细胞转化的区别。 • 酵母菌属于真核生物 ,大肠杆菌是细菌属于原核生物 . • 酵母转化在室温，大肠杆菌转化在冰上 • 酵母转化用醋酸锂，大肠杆菌转化用氯化钙 • 酵母转化用穿梭质粒，大肠杆菌转化用普通质粒
30Cycles
目前研究转基因植物外源基因 转录表达的常用方法
1、RT-PCR (RNA)
2、Northern blot (RNA)
3、real-time PCR (RNA ）
结果与分析
• 利用凝胶成像分析仪对电泳结果进行拍照和结果记录； • 观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的
300
400
500
600
头孢唑啉钠 -
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Βιβλιοθήκη Baidu
头孢哌酮钠 -
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头孢曲松钠 -
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头孢噻肟钠 -
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-：表示无抑制作用；+：表示抑菌圈在8-10mm不透明；++：表示抑菌圈在 10-15mm不透明；+++：表示抑菌圈在15-25mm透明；++++：表示抑菌圈大 于25mm透明；+++++：表示菌板透明，无菌落。
实验目的
1、检测外源基因在植物细胞中的转录，对外 源基因表达调控进行研究，掌握引物的选择 、cDNA的合成、RT-PCR检测的原理与方法。
。
实验材料、设备及试剂
1、材料： 转基因植物的RNA或mRNA制备物。 非转化的植株材料总RNA或mRNA制备物
2、设备：PCR仪、移液器、PCR管等。 3、试剂：10×RT缓冲液、dNTP、逆转录酶、 引物
0.25 μl
AMV RTase Transcriptase
0.5 μl
oligo dT-Adaptor primer
0.5 μl
RNA
1μl
Total
10μl
反应条件：
42 ℃ 30min 99 ℃ 5min 5 ℃ 5min
3、PCR反应
取一个0.2ml的PCR管，依次加入下列试剂：
10×PCR Buffer
4 μl
灭菌蒸馏水
9μl
10 mM dNTP
２.5 μl
Taq酶
0.1 μl
上游特异Primer (20 μM)*1
0.2 μl
下游特异Primer (20 μM)*2
0.2μl
Total
16 μl
将（1）的反应结果稀释20倍，取10 μl 加入到（2）管中，
轻轻摇匀。
反应条件：
94℃ 2min 94 ℃ 30s 55 ℃ 30s 72 ℃ 1min 72 ℃ 7min
电泳谱带分子量和谱带的特异性，确定和描述谱带特征。
RT-PCR扩增得到的810bp的目的基因产物的电泳结果
实验报告
1、将实验结果粘到实验报告上。 2、 如何选择RT-PCR的反转录引物。 3、结合实验结果，试论应用RT-PCR研究外
源基因转录表达的优缺点。
实验一、质粒三种提取方法的比较
为什么要用对数期的菌液提取质粒 ？ 因为对数期菌的 生长状况和数量最佳,有利于提取质粒 溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的作用？ • 溶液Ⅰ 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0 • 葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑 制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并 且可以在后续步骤中被除去 • 溶液Ⅱ 0.2M NaOH / 1% SDS • 破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。 • 溶液Ⅲ 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸 • 这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基 磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分 子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了 ，同时基因组DNA也被PDS共沉淀
• 穿梭质粒是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择
标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载 体。 比如说通常能够在哺乳动物，酵母或者其他细菌复制表 达的质粒，同时可以在大肠杆菌内复制。这样利于对质粒的 分子生物学操作和大量制备。
实验三、侵染菌种对除菌抗生素的敏 感性
头孢酶素 100 200