《蛋白表达概述》PPT课件
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缺点： ①糖基化与哺乳动物有所差别； ②表达量有限； ③作为药物宿主细胞未被FDA认可； ④培养成本高。
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5
哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞常用于表达高活性的人源重组蛋白。
优越性： ①糖基化与人源蛋白一致； ②能表达天然结构的完整蛋白，活性很高； ③可进行分泌表达。
缺点： ①表达量低； ②培养成本很高，操作繁琐。
缺点： ①因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体； ②蛋白质不能糖基化； ③其内毒素很难除去。
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3
酵母表达系统
甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统，以Pichia Pastoris应用最多。
优越性： ①蛋白可糖基化，有相对正确的天然结构，可很好的生产分泌型蛋白； ②表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母 染色体中，实现高效率表达； ③表达载体都为E.coli/Pichia Pastoris的穿梭载体，可在获得克隆后采用E.coli细胞大量 扩增。 ④易培养，成本低,可高密度发酵。
选择合适的载体需要考虑的因素： 目的蛋白的应用 目的蛋白已知特定信息 克隆策略
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12
目的蛋白的应用
分析级表达量的蛋白用于活性分析，筛选及确定突变，筛选配体相互作用，制 备抗原等。大量活性蛋白用于结构研究，作为试剂或制备亲和基质。可能有多 种载体都能满足表达用于筛查或抗原制备所需的分析级表达量的要求，但是， 能用于大量纯化的载体-宿主菌-培养条件的最佳组合条件往往是唯一的。如果要 连续生产大量高活性的目的蛋白，那么多花些功夫摸索载体-宿主菌-培养条件的 组合以便找到最佳条件，是非常值得的。
正确选用合适的载体和宿主菌组合会明显提高目的蛋白可溶部分比例及活性。载体 可以通过三种方式增加可溶性：1)与本身溶解性高的多肽序列融合表达 (GST，Trx及 NusA)；2) 与催化二硫键形成的酶融合表达(例如Trx，DsbA，及DsbC)；3) 与信号序 列融合表达，输出到细胞周质。
缺点： ①糖基化与哺乳动物有所差别； ②培养上清多糖浓度高，不利于纯化。
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4
昆虫细胞表达系统
利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式。
优越性： ①重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配； ②可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体； ③可进行分泌表达。
Expression plasmid features
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Induction of expression
9
pET载体E.coli表达蛋白流程
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10
pET system
Fetures:
popular Low basal expression levels Widest variety of fusion tags Specialized vectors and hosts Competent cells
对于我们来说，最常用和最需掌握的是大肠杆菌表达系统
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7
Factors in E.coli protein expression
vector
Strain
growth conditions
一个蛋白要成功的在E.coli系统表达，就是要根据表达目的在载体，菌株和培养条件三 个主要因素之间找到一个理想的结合点。以达到⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定 ;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。
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6
各种表达系统各有其优缺点，大肠杆菌和酵母表达系统蛋白表达水平高，生产成本低， 但它们的加工修饰体系与昆虫细胞、哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白 质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。
各种表达系统由于翻译后的加工不完全相同，因而产生的重组蛋白的生物学活性和免疫 原性有时会有差别。因此，选择表达系统时，必须充分考虑各种因素，如所需要表达的蛋 白是否有毒性，是否有活性，是否需要糖基化，还需要考虑成本、产量及纯化路线和安全 性。
蛋白表达概述
Michael Chao
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1
常用蛋白表达系统(host)
原核细胞：大肠杆菌。 真核细胞：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞
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2
大肠杆菌表达系统
大肠杆菌是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。
优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解； ②商品化的载体和菌株种类非常齐全； ③表达效率高； ④易培养，成本低。
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8
表达载体(Vector)
原核表达载体众多，常用的有pET(T7 promoter)、pQE(T5 promoter)、pGEX(GST融 合表达)等。 各载体适应的菌株也不尽相同pET(BL21(DE3))、pQE(M15,JM109)、pGEX(BL21)。 对于我们来说，最常用和最需掌握的是pET表达系统
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13
目的蛋白的已知特性
任何有关目的蛋白的信息都有助于选择合适的载体。例如，有些蛋白表现活性 要求一端或两端均无外源序列。大多数pET 载体可以克隆非融合序列；但是， 如果特定翻译起始序列在 E. coli 中不能被有效使用，表达水平也会受到一定的 影响。在这种情况下，通常是构建一种带有高效表达的氨基末端序列的融合蛋 白，并在纯化完成后用特定的蛋白酶切去融合序列。
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11
选择合适的载体
载体大致可分为两大类：转录载体和翻译载体。
转录载体用以表达本身带有原核核糖体结合位点和AUG起始密码子的目的基因。只 有3种转录载体：pET-21(+)、pET-24(+)和pET-23(+)。 翻译载体包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效核糖体结合位点，用于表达那些不 带有核糖体结合位点的目的基因
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14
克隆策略
不同的克隆策略、对限制性酶切位点及阅读框的不同要求，会影响对载体的选 择。许多pET 载体具有同样的限制性酶切位点，那么可以仅准备一次目的插入 片段，将其插入到多个载体中。不同的要求可以考虑采用不同的PCR 克隆策略。
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15
蛋白溶解性和细胞定位
一旦确定了用途和克隆策略，下一步就是判断目的蛋白在细胞中的定位和可溶性。 许多后续应用要求目的蛋白以有活性的可溶状态表达。大多数情况下，可溶性并非有 或无的现象。
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5
哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞常用于表达高活性的人源重组蛋白。
优越性： ①糖基化与人源蛋白一致； ②能表达天然结构的完整蛋白，活性很高； ③可进行分泌表达。
缺点： ①表达量低； ②培养成本很高，操作繁琐。
缺点： ①因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体； ②蛋白质不能糖基化； ③其内毒素很难除去。
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酵母表达系统
甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统，以Pichia Pastoris应用最多。
优越性： ①蛋白可糖基化，有相对正确的天然结构，可很好的生产分泌型蛋白； ②表达载体为整合型质粒，载体中含有与酵母染色体中同源的序列，因而比较容易整合入酵母 染色体中，实现高效率表达； ③表达载体都为E.coli/Pichia Pastoris的穿梭载体，可在获得克隆后采用E.coli细胞大量 扩增。 ④易培养，成本低,可高密度发酵。
选择合适的载体需要考虑的因素： 目的蛋白的应用 目的蛋白已知特定信息 克隆策略
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目的蛋白的应用
分析级表达量的蛋白用于活性分析，筛选及确定突变，筛选配体相互作用，制 备抗原等。大量活性蛋白用于结构研究，作为试剂或制备亲和基质。可能有多 种载体都能满足表达用于筛查或抗原制备所需的分析级表达量的要求，但是， 能用于大量纯化的载体-宿主菌-培养条件的最佳组合条件往往是唯一的。如果要 连续生产大量高活性的目的蛋白，那么多花些功夫摸索载体-宿主菌-培养条件的 组合以便找到最佳条件，是非常值得的。
正确选用合适的载体和宿主菌组合会明显提高目的蛋白可溶部分比例及活性。载体 可以通过三种方式增加可溶性：1)与本身溶解性高的多肽序列融合表达 (GST，Trx及 NusA)；2) 与催化二硫键形成的酶融合表达(例如Trx，DsbA，及DsbC)；3) 与信号序 列融合表达，输出到细胞周质。
缺点： ①糖基化与哺乳动物有所差别； ②培养上清多糖浓度高，不利于纯化。
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昆虫细胞表达系统
利用重组杆状病毒在昆虫细胞体系中表达外源蛋白是目前较为流行的表达方式。
优越性： ①重组蛋白具有完整的生物学功能，如蛋白的正确折叠、二硫键的搭配； ②可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体； ③可进行分泌表达。
Expression plasmid features
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Induction of expression
9
pET载体E.coli表达蛋白流程
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pET system
Fetures:
popular Low basal expression levels Widest variety of fusion tags Specialized vectors and hosts Competent cells
对于我们来说，最常用和最需掌握的是大肠杆菌表达系统
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Factors in E.coli protein expression
vector
Strain
growth conditions
一个蛋白要成功的在E.coli系统表达，就是要根据表达目的在载体，菌株和培养条件三 个主要因素之间找到一个理想的结合点。以达到⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定 ;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。
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各种表达系统各有其优缺点，大肠杆菌和酵母表达系统蛋白表达水平高，生产成本低， 但它们的加工修饰体系与昆虫细胞、哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白 质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作繁琐。
各种表达系统由于翻译后的加工不完全相同，因而产生的重组蛋白的生物学活性和免疫 原性有时会有差别。因此，选择表达系统时，必须充分考虑各种因素，如所需要表达的蛋 白是否有毒性，是否有活性，是否需要糖基化，还需要考虑成本、产量及纯化路线和安全 性。
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常用蛋白表达系统(host)
原核细胞：大肠杆菌。 真核细胞：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞
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大肠杆菌表达系统
大肠杆菌是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。
优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解； ②商品化的载体和菌株种类非常齐全； ③表达效率高； ④易培养，成本低。
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表达载体(Vector)
原核表达载体众多，常用的有pET(T7 promoter)、pQE(T5 promoter)、pGEX(GST融 合表达)等。 各载体适应的菌株也不尽相同pET(BL21(DE3))、pQE(M15,JM109)、pGEX(BL21)。 对于我们来说，最常用和最需掌握的是pET表达系统
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目的蛋白的已知特性
任何有关目的蛋白的信息都有助于选择合适的载体。例如，有些蛋白表现活性 要求一端或两端均无外源序列。大多数pET 载体可以克隆非融合序列；但是， 如果特定翻译起始序列在 E. coli 中不能被有效使用，表达水平也会受到一定的 影响。在这种情况下，通常是构建一种带有高效表达的氨基末端序列的融合蛋 白，并在纯化完成后用特定的蛋白酶切去融合序列。
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选择合适的载体
载体大致可分为两大类：转录载体和翻译载体。
转录载体用以表达本身带有原核核糖体结合位点和AUG起始密码子的目的基因。只 有3种转录载体：pET-21(+)、pET-24(+)和pET-23(+)。 翻译载体包括来自T7噬菌体主要衣壳蛋白的高效核糖体结合位点，用于表达那些不 带有核糖体结合位点的目的基因
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克隆策略
不同的克隆策略、对限制性酶切位点及阅读框的不同要求，会影响对载体的选 择。许多pET 载体具有同样的限制性酶切位点，那么可以仅准备一次目的插入 片段，将其插入到多个载体中。不同的要求可以考虑采用不同的PCR 克隆策略。
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15
蛋白溶解性和细胞定位
一旦确定了用途和克隆策略，下一步就是判断目的蛋白在细胞中的定位和可溶性。 许多后续应用要求目的蛋白以有活性的可溶状态表达。大多数情况下，可溶性并非有 或无的现象。