大肠杆菌表达重组蛋白的细胞冻融与超声破碎

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一可溶性蛋白的纯化

（一）菌体的破碎

1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH ；50ml 离心管；冷冻高速离心机

2. 方法

反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。

菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA 的终浓度为。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。

取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。

注意事项：

（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。

（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。

（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford 法或者紫外吸收法。

（4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。

二包涵体蛋白的纯化

1 菌体的破碎（加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了）

仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH ；裂解液bufferA；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml离心管；冷冻离心机

方法

(1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。

（2）菌体沉淀中加入相同菌液体积的20mM PBS 或20mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH，一般为），重悬洗涤2-3次，弃掉上清。

（3）然后沉淀按原菌液体积每500ml以15ml预冷的裂解液bufferA重悬。(有的文献为每克湿菌加4ml -10ml裂解液)

（4）每毫升悬液中加入100ul 10mg/ml溶菌酶（即溶菌酶终浓度1mg/ml）。在冰上孵育15min

（5）对15ml悬液进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数。超声破碎时保持冰浴。具体条件可根据实验情况而定。

（6）4℃，4000 rpm/min离心20分钟所得沉淀即为包涵体。

注意事项：融合蛋白的分子量如果大于150KD时，用超声波破碎很容易将目标蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做处理.

2 包涵体的洗涤

(1) 将包涵体沉淀重悬于含有适量脲（1-4M）的Buffer A中，每克湿重加4-6ml洗涤液。

(2) 超声波处理5秒打碎沉淀，继续用注射器吸入并挤出悬液，重复数次，4℃涡旋悬液30min。或者高速搅拌悬液10min。

(3) 4℃，4000 rpm/min离心15分钟。

(4) 重复上述操作2次至上清液透明无色。

(5) 将包涵体沉淀重悬于Buffer A，4℃，4000 rpm/min离心15分钟，弃掉上清。

BufferA 50mM Tris-HCl pH 8,

0.2mM EDTA,

100mM NaCl,

1% Triton x-100 （或2% 脱氧胆酸钠）

1mM DTT

1mM PMSF

溶菌酶 10mg/ml

注意事项：

(1) 包涵体洗涤时增加NaCl浓度到0.5M，有助于包涵体中杂蛋白的溶解。

(2) 经提取洗涤后得到的包涵体，由还原SDS-PAGE电泳结合光密度扫描可知包涵体中目标蛋白的含量。

(3) 包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，不同培养条件下收集的菌液经洗涤可得到不同的纯度。

(4) 用通常的洗涤方法，如果包涵体达不到所需的纯度，可试用分级沉淀法初纯包涵体，步骤如下：

(1) 菌体破碎后将所得的包涵体悬浮于含6mol/L盐酸胍的Buffer A中，4℃涡旋悬液30min ，4000r/min离心20min，上清进行分级沉淀。

(2) 取一小部分上清用Buffer A稀释到盐酸胍浓度为4 M，然后4℃涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，上清继续稀释到3M，重复上面操作一直到2M，把每次沉淀和上清跑SDS-PAGE电泳分析，看目标蛋白在哪个盐酸胍浓度下纯度最高。

(3) 摸索好条件后，直接将剩余上清直接用Buffer A稀释到所需的盐酸胍浓度，然后4℃涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，沉淀既为分级沉淀后的包涵体。

蛋白质浓度测定

蛋白质浓度测定方法很多，每种方法都有其自身的优点和缺点以及适用范围，不同的实验条件下得到的蛋白测定浓度需要根据纯化蛋白缓冲体系选择合适的测定方法。

一、考马斯亮蓝法（bradford法）－

在本实验室中主要用来检测经谷胱甘肽亲和层析柱纯化后蛋白浓度测定

（一）实验原理考马斯亮蓝法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 /&B Ie`

bradford法的突出优点是： ~G_Z~ |

（1）灵敏度高% w

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。