免疫组化教程

第一章免疫细胞化学基本概念及发展简史

一．免疫细胞化学的基本概念

免疫细胞化学（immunocytochemistry）是利用特异性抗原抗体反应，观察和研究组织细胞特定抗原（或抗体）的定位和定量的技术。

应用免疫细胞化学技术可以在光镜和电镜水平观察细胞膜及细胞内某种抗原物质的存在。从而为生物医学研究生命大分子，特别是那些对细胞化学方法来说尚无作用物或作用物特异性不强的酶、蛋白质、激素及受体蛋白等在组织内分布、细胞内定位以及代谢状态等，提供了特异性强、灵敏度高而又直观化的原位分析细胞组成物质的细胞化学手段。

二．免疫细胞化学的发展简史

1941年，Coons等创立了荧光抗体法

1959年，Singer创立了铁蛋白法

1966年，Nakane等创立了免疫酶技术

1971年，Faulk和Taylor 创立了免疫胶体金法

1976年，Bayer等提出了亲合组织化学法

第二章免疫细胞化学相关的组织学和细胞学技术

一．取材

（一）组织标本的取材

1.活检钳的刃口锋利，以免组织受挤压。

2.取所需组织：主要病变区、病灶与正常组织交界区。必要时取远

离病变区的正常组织作为对照。

3.为充分保存组织的抗原性, 取材要快，尽量保持组织新鲜。（二）细胞标本的取材

1．印片法

应用：活检标本、手术切除的标本。

方法：新鲜标本以最大面剖开暴露病区，载玻片轻压病区，脱落细胞黏附于载玻片上，立即浸入固定液中5－10分钟，取

出自然干燥，低温保存。

优点：简便省时，细胞抗原保存较好。

缺点：细胞分布不均重叠，影响标记效果。

2．穿刺吸取涂片法

应用：实质器官的病变区。

方法：①穿刺液较少时直接涂片，力求均匀。

②穿刺液较多时，穿刺液滴入1－2毫升Hanks液（RPMI

1640液）内，轻搅，500rpm离心5－10分钟，弃上清，

制成细胞悬液（2x106细胞/ml）,吸一滴于载玻片上，轻涂，

干后固定。

优点：细胞均匀。

缺点：细胞易变形。

3．体液沉淀涂片法

①细胞数多，取一滴直接涂片。

②细胞数少，取5毫升自然沉淀液以1500rpm离心10分

钟，弃上清，将沉淀涂片，略干后固定备用。

4．培养细胞

①贴壁生长的细胞：将盖玻片插入培养液中。

②悬浮生长的细胞：可用离心涂片法制成涂片。

5．离心涂片机法

细胞悬液2⨯105~6，1000r/min，2min，50~100μl。

注意事项：

①防止脱片, 涂黏附剂，。

②为节省试剂及便于镜下观察和计数，将细胞集中到直径

0.6-1.0cm圆圈内，细胞总数以105为宜。

③粘液丰富的标本如胃液、痰液等未经特殊处理，不宜作

免疫组化。

二．固定

（一）免疫组化的固定法

选择最佳固定的标准

最好的保存细胞和组织的形态结构。

最大限度的保存抗原的免疫活性。

固定有：

（1）物理固定：血膜空气快速干燥，冻结干燥。

（2）化学固定：

固定方法

1. 浸润法（immersion method）4－24小时。

2. 灌流法( irrigation method )

麻醉动物，经动物左心室主动脉插管，生理盐水冲洗，注入固定液，组织在30分钟内取材。

（二）重要的固定液

1．10％中性缓冲福尔马林

双功能交联剂。使组织间相互交联，保存抗原于原位。特点是对组织穿透性强，收缩性小，易使组织硬化而浸蜡困难。

固定时间不宜过长。

2．4%多聚甲醛磷酸缓冲液

适应性较广泛的固定液，固定时间不宜过长。3．Bouin,s液

对组织固定力强且较均匀。比单独醛类固定更适合免疫组化染色，4 0C。

4．Zamboni,s液

可用于光镜、电镜免疫细胞化学观察。采用 2.5%多聚甲醛和30%饱和苦味酸，更可增加对组织的穿透力和固定效果，以保存更多的组织抗原。6~18小时。

5．丙酮

用于冰冻切片及细胞涂片的固定。固定较好，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好，染色效果稍差。4 0C，5－10分钟，干燥后低温保存。

6．95％乙醇

用于冰冻切片及细胞涂片的后固定。固定效果差，可和其他试剂混合使用，染色较好。

7．AAF液：

较常用的固定液。（95-100%酒精85ml, 冰醋酸5ml, 浓甲醛10ml.）

（三）固定剂的选择

各种抗原的最佳固定剂的选择见表。鉴于10%中性甲醛是国际最通用的固定剂，虽然它对保存Ig抗原方面较差，若采用合适的蛋白酶消化处理，进一步暴露抗原，结合使用敏感的免疫组化方法，如PAP，ABC法，仍不失为一可用的固定剂。固定时间可适当缩短至16-24小时。

免疫球蛋白类抗原可选用含汞类的固定液，(如Zenker固定液)，或蛋白沉淀性固定液(如Bouin固定液，甲醛醋酸酒精固定液等)。扁桃体、淋巴结和骨髓还可用甲缩醛(formal-Saline)加2-10%醋酸，石蜡切片，能有效地保存Ig。

肿瘤胚胎抗原(如甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA)对多种固定均稳定。一般可用中性福尔马林固定，石蜡包埋切片）

激素类中的多肽类激素宜选用Bouin。

组织之中酶和一些组织特殊抗原(如肌球蛋白、凝血蛋白和第VIII凝血因子等)可用10%中性甲醛。

待测抗原与固定液的关系

抗原适用固定液