第五章聚合酶链式反应(PCR技术)

DNA GGAUCG
聚合酶
5‘
合成引物
5‘AUCGCG A聚DT合NAA酶GCGTAGCTGCGAGGATCG
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
PCR技术简史
1971年，Khorana提出：经过DNA变 性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶 延伸引物，并不断重复该过程便可 克隆tRNA基因。
计划是Mullis发表PCR原理的文章，技术员Randall Saiki写PCR应用的 文章。第一篇提到PCR这个方法的论文于1985年12月20日发表在《科 学》周刊上，Mullis排第四。Mullis自己写的论文则被《自然》和《科 学》拒绝，最后在1987年发表在《酶学方法》（Methods of Enzymology）。
3’
解旋解链
GGAUC引G 物酶5‘
合成引物
RNA引物
RNA引物
5引‘ A物UC酶GCG
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
PCR技术简史
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCT
美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属Cetus。 Cetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一项与 PCR 有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR有关试剂 和仪器
同一年，Cetus与Perkin-Elmer公司合资成立公司，开始研究 和生产DNA热循环仪，Perkin-Elmer占了51％。这个极为明 智的51％成为当时的PE后来的ABI公司笑傲江湖的重要基础。 迄今为止ABI平均每年获得由各公司上缴的高达5千1百万美 金的专利使用费！
《基因工程原理》
山东理工大学生命科学学院
第七章 聚合酶链反应（PCR技术）
PCR技术简史 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用
多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction)
Polymerase: DNA聚合酶
多聚酶链式反应（PCR）：一种体外扩增DNA的方法。PCR使用一种耐热 的多聚酶，以及两个含有20个碱基的单链引物。经过高温变性将模板DNA 分离成两条链，低温退火使得引物和一条模板单链结合，然后是中温延伸， 反应液的游离核苷酸紧接着引物从5‘端到3’端合成一条互补的新链。而新合 成的DNA又可以继续进行上述循环，因此DNA的数目不断倍增。
一 PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶
5’
PCR技术简史
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
Kary B. Mullis（1944－）
http://www.karymullis.com
1972年Kary Mullis在加州大学伯克利分校取得生物化 学博士学位，专长有机合成。桀骜不驯的他在那个嬉 皮年代居然在吸食自制的迷幻药，经历迷幻药之旅的 过程中居然想出了某个解释大爆炸宇宙学的理论，写 了出来投稿到《自然》周刊，居然登了出来，并因此 拿到了博士学位。
1979年，Mullis进入Cetus生 物技术公司负责合成寡核苷 酸以供实验所需。在1983年 春天的一个周五晚上，他偶 然想出了DNA片断的聚合酶 链发应方法。
散漫而拖拉的Mullis直到同年8月首次在公司里正式作了有关PCR原理 的报告。1983年9月起到1984年11月，在2位技术员协助下取得可信的 结果。1985年Cetus高层于3月申请专利。
但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆基因成为可能，所以，Khorana的 设想被人们遗忘了……
Kary Mullis(1985)
发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:
“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片 段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月 色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。
Mullis与Cetus公司分道扬镳，Mullis只获得了5个月薪水和 10000美元奖金，PCR专利权按业界的惯例留给了Cetus， 而后者转手就以3亿美元的天价卖给了药业巨头Roche。
1998年ABI和Roche起诉MJ Research公司侵犯PCR专利权， 2004年此案最终判决，MJ公司被判赔偿ABI损失1980万美 元，日本和德国等国家随后纷纷禁止生产和销售MJ公司 的产品，MJ公司申请破产保护，被Bio-Red低价收购。
随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循 环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
Kary B. Mullis
<<The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction>>
1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科 学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年，Mullis荣获 1993年度诺贝尔化学奖。
专利官司
1987年美国专利局专利授权 1989年，DuPont异议，大小公司对簿公堂。DuPont理由 是，1971年PCR的雏形已由Khorana一系列文章阐明，并 公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究 DNA聚合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知 识的人都可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。
Mullis 的构思
引物 DN源自文库聚合酶 DNA聚合酶 引物
特定DNA片段
PCR技术简史
1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR）
基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶
不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，