第四章 酶的固定化

将酶包埋在凝胶的微小空格内或埋于半透膜的微型胶
束内，但底物仍能渗入到里面与酶接触。 优点：利用此法制得的固定化酶，由于酶分子仅仅是被 包埋起来，而未受到化学作用。酶蛋白几乎不起变化， 可适用于多种不溶酶的制备。 When immobilized in a polymer(聚合体) matrix, enzyme solution is mixed with polymer solution before polymerization(聚 合反应) takes place.
SUMMARY 总结
The most suitable support material and immobilization method vary depending on the enzyme and particular application(应用).
Then how to select support materials ?
生化工程
姚璐晔
第四章
讲授内容：
固定化酶
• 什么是固定化酶
• 制备固定化酶的依据 • 固定化技术 • 固定化酶的形状和性质 • 固定化酶的应用 • 固定化细胞 • 固定化酶动力学
Immobilized Enzyme
Definition(定义)
The restriction of enzyme mobility in a fixed space is known as enzyme immobilization. In general, immobilized enzymes are enzymes that are attached to, or entrapped within, a macroscopic support matrix so that the resulting catalyst can be reused.
有最小的空间位阻；

固定化酶应有最大的稳定性； 固定化酶应易与产物分离。
固定化技术
包埋法
MatrixEntrapped 网格型
Immobilized Soluble Enzymes
吸附交联
共价交联(结 合)CovalentlyBound To Support To Enzyme
吸附法 MembraneEntrapped微囊型 Adsorbed(Phys
缺点：酶被包埋在内部，对大分子底物很难发生催化作用。
所以用包埋法制备的酶，一般只适用于小分子底物。 包埋法又分为：微胶囊包埋法, 胶格包埋法
In all cases, a semi-permeable(半渗透性) membrane is used to retain high-MW compounds (enzyme) while allowing small-MW compounds (substrates or products) access to the enzyme.
Microencapsulation: a special form of membrane entrapment.
微胶囊包埋法
将酶包埋在半透性聚合体膜内，形成的直径为1~100um。
例如，天冬氨酸酶（asparaginase)就是用这种方法作
成微胶囊。
胶格包埋法
首先被采用的胶格包埋法是： • 固定化胰蛋白酶 • 木瓜蛋白酶 • －淀粉酶 Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰 胺, 丙稀酰胺
固定化氨基酰化酶
交联法（Cross-Linking）
依靠双功能基团的试剂，使酶蛋白分子之间发生交联， 凝集成网状结构而成为固定化酶，最常用的双功能试剂有戊 二醛、顺丁稀二酸酐和乙烯共聚物等。那么酶蛋白中的游离 氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。
The enzyme molecules can also cross-link with each other. But this may cause significant changes in the active site of enzymes, and also severe diffusion(扩散) limitations may result.
a. Binding(连结) capacity, which is a function of charge density, functional groups, porosity, and hydrophobicity(疏水性); b. Stability and retention of the enzyme activity, which is a function of groups on support material and microenvironmental conditions.

Adsorption A physical attachment of enzyme on the surfaces of support particles by weak physical forces: van der Waals(范德华力).
物理吸附法(Physical adsorption)
固定化酶：是被固定在某一有限空间内不再能自 由流动而仍有催化活性的酶。通过吸附或包埋于 载体上达到固定的目的,致使酶能重复利用.
优点Advantages ：
不溶于水，易于与产物分离； 可反复使用； 可连续化生产； 稳定性好。

缺点Disadvantages ：
固定化过程中往往会引起酶的失活。
Two oppommobilized enzyme 固定化酶 Free enzyme游离酶
制备固定化酶的依据 (Principle of preparing Immobilized Enzyme )

固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化能力 和常温、常压下能起催化反应等特点；

Matrix entrapment 胶格包埋
Matrices used for enzyme immobilization are usually:
Ploymeric materials: Ca-alginate（海藻酸钙）, ĸcarrageenin（角叉菜胶 ）, polyacrylamide(聚丙烯酰胺), collagen(卡拉胶); Solid matrices: activated carbon, （多孔陶瓷）, diatomaceous earth（ 硅藻土）.

Membrane entrapment 膜包埋
Membrane: nylon, cellulose(纤维素), polysulfone(聚砜), polyacrylate（聚丙烯酸盐）.
吸附法(Adsorption)
酶被吸附于惰性的固相载体或离子交换剂。根据酶分子与
载体吸附的性质有物理吸附和离子吸附之别。
使用对酶蛋白有高度吸附能力的硅胶、活性炭，氧化铝、 高岭土、石英沙、火棉胶、多孔玻璃等在一定条件下与水溶 酶作用制得。
这些具有吸附能力的物质就叫做载体。
物理吸附法(Physical adsorption)
优点：操作简单，反应条件温和，酶活力损失少，载体
可反复使用。
缺点：易引起蛋白质表面变性，且由于结合力弱，当反
应液的pH值、离子强度、温度、底物浓度等发生变化时， 会导致酶易从载体上部分或全部脱落。
离子结合法 (Ionic adsorption)
利用含有离子交换基团的固相载体（如具有交换基团 的葡聚糖凝胶或纤维素）与酶蛋白分子的带电基团互相 吸引（靠离子链）而形成络合物。
离子结合法 (Ionic adsorption)
共价结合法(Covalent Binding)
酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆 的连接。一般在温和条件下能参与偶联的蛋白质基团包
括：游离羧基（包括肽链C-末端的α-羧基等）、游离
氨基（如肽链N-末端的α-氨基）等。 It is the retention(滞留) of enzymes on support surfaces by covalent bond formation, via certain functional groups(官 能团), such as amino, carboxyl(羧基), hydroxyl(羟基), and –SH group. The functional groups must not be the active sites(活性位点).
Easy High
Unchangeable
Difficult Low
Changeable
Difficult Low
Changeable
Easy High
Unchangeable
Weak
Moderate
Strong
Strong
Strong
Possible
Low
Possible
Moderate
Impossible
双功能试剂：常用的是戊二醛
O
O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H 使用戊二醛的酶固定化的交联方式：
图 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价结合酶分子；
(a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定 化酶；（b）酶分子被结合到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
Table: Comparison of the Characteristics of Different Methods of Enzyme Immobilization 酶固定化方法的比较
Carrier Binding Methods与载体的连接方式 Characteristic 性 能 Physical adsorption 物理吸附 Ionic Binding 离子吸附 Covalent Binding 共价结合 Crosslinking Method 共价交联 Entrapping Method 包埋