拟南芥β-罗勒烯合成酶基因T-DNA插入突变体的鉴定

２ ‘ 置 ２ ｎ ，４００ｒｍ 离 心 １ ｎ 吹干 ， 于 ０Ｃ放 ０ｍｉ）１ ０ ｐ ０ｍｉ， 溶
灭菌 的超 纯水 中后作 为 Ｐ Ｒ扩增 的 Ｄ Ｃ ＮＡ模 板 。
１ ２ ３ ＤＮＡ 的 Ｐ Ｒ 扩 增 ． ． Ｃ
相 似 基 因组 成 的 家 族 命 名为 Ａｔ Ｐ Ｔ Ｓ家 族 。 ｔ ＰＳ ３ Ａ Ｔ ０
１ ２ ２ 单株 植物 总 ＤＮＡ 提取 ．．
类 化 合物 都 具 有 环状 结 构 。单 萜 合酶 分 布 于 ＴＰ — ， Ｓｂ
ＴＰ — ， Ｐ — 和 Ｔ Ｓ ｇ４个 亚家 族 。单 萜 合酶 基 因表 Ｓｄ Ｔ Ｓｆ Ｐ — 达 受 生物 钟 调节 ， 表达 量 随 昼 夜周 期 交替 变换 而 出现
ｆ罗勒烯 （－ｃｍｅｅ 是 近 年 来 发 现 的 ， 植 物 防 ｝ － ￣ｏｉ ｎ ） 与 御 相 关 的 植 物 通 讯 （ｌｎ—ｏ ｐａ ｔｃｍｍｕ ｉ ｔ ｎ） 号 分 ｎｃ ｉ 信 ａｏ 子 ［， 自然 界 中包 括 两 个 同分 异 构 体 ： 式一 勒 １在 ］ 顺 罗
烯 （ ｉ一 ｃ ｎ ｃ ￣ｏ ｉ ｅ）和 反 式一－ 勒 烯 （ ｒｎ — ｓ ｍｅ ｆ罗 ｝ ￣ａ ｓ ｏ ｉ ｎ ） 罗勒 烯 是 一 种 单 萜 （ ｎ ｔｒｅ ｅ ） 合 ｃ ｍｅ ｅ 。 ｍｏ ｏｅｐ ｎ ｓ 化
ｓｕ ｙｔｅｒｌ ｏ ￣ｏ ｉ ｎ ｃ ａ ｉ ｔｄ ｏｅ ｆ ｃ ｈ ｍｅ ｅｍｅｈ ｎｓ ｈ ｍｏｙ ｏ ｓｍｕａ ｔ ｉ －ｃ ｎ ｙ ｔａｅ ｅ ｅｅｐｅｓ ｎｓｅ ｃ ｓ ｂ ｏ ． ｍ・ ｏ ｚｇ ｕ ｔｎ ｔ ｏｉ ｅｓｎｈ ｓ ｎ ｘ ｒｓｉ ｉ ｎｅｍｕ ｔ ｅｇ ｔ ｗ ｈ￣ ｍｅ ｇ ｏ ｌ
Ｒ ０ １ Ｌ， ｄ Ｈ２ 补 足至 １ Ｌ。 ． 用 ｄ Ｏ ５
Ａｔ ＴＰＳ基 因家 族 中的一 员・ ｅ ｎ Ｊｎ ｙ等 人［］ 过 ｃ ＮＡ ２通 。 Ｄ 克 隆 ， 定 了 一 个 基 因 ｆ 鉴 ＰＳ ３， 能 编 码 单 萜 合 Ｏ 它 酶 ， 种单 萜 合酶 能高 特 异性 催化 香 叶基 二磷 酸 生成 这
烯 能激 发与 受 害植 株相 邻的 植株 产生诱 导性 防御反 应 并 改变 相 邻 植 物体 内的代 谢 途 径 ， 对病 原 微 生物 产 生 抗 性 或对 食 草 动物 产 生 驱赶 作 用［叫 １ 。刘 春林 等 ［］ １ ＂ 以拟 南 芥 为 材 料 ， 别 选 择水 杨 酸 信号 传 导途 径 启 动 分
Ａｃ ｏ ｄｎ ｏ ｔ ｅｉｆ ｒ ｔ ｎ ｐ ｌ ｈ ｄ ｏ ｈ ｃ ｒ ｉｇ ｔ ｈ ｎｏ ｍａ ｉ ｕｂｉ ｅ ｎ ｔｅ ＴＡＩ ｗｅ ｓｔ ｏ ｓ Ｒ ｂ ｉ ｅ，ｗｅ ｂ ｕ ｈ ｈ ＤＮＡ ｎ ｅ ｔｏ ｕａ ｔｏ ｈ ８ｏ ｉ ｎ ｏ ｇ ｔｔ ｅＴ— ｉｓｒｉｎ ｍ ｔ ｎ ｆｔ ｅ／ ｃｍｅ ｅ －
２１年 第２ ０１ ５卷 第 ５ 期
作 物 研 究
４７ ７
拟南芥 』罗勒烯 合成酶基 因 Ｔ— ＮＡ 插入 突变体的鉴定 ３ 一 Ｄ
马泉芳 ， 魏 然， 刘春林
（ 湖南农业大学农学院 ， 长沙 ４ ０ ２ ） １ １ ８
摘
要 ：ｐ岁勒烯 （ ｃｍｅｅ 是一种单萜挥发性有机物 ， － ￣Ｏ ｉ ｎ ） 亦是一种重要的植物通讯信号分子 。为了进一步研究 罗勒烯的
Ａ ｓｒｃ ： ｌｏ ｉ ｎ ｓ ｏ ｅ ｏ ｏ ｏｅ ｐ ｎ ｂ ｔａ ｔ ｇ ｃｍｅ ｅ ｉ ｎ ｆｍ ｎ ｔｒ ｅ ｅ，ａ ｍｐ ｒａ ｔｐａ ｔｃ ｍｍ ｕ ｉａ ｉｎ ｓｇ ａｉｇ ｍｑｅ ｕ ｅ Ｉ ｒｅ Ｏ ｆｒｈ ｒ － ｎ ｉ ｏ ｔｎ ｌｎ ｏ ｎｃ ｔ ｉｎ ｌ ｌｅ ｌ． ｎ ｏ ｄ ｒｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｎ
Ｅ ａｌｍｑ— ｉ ２ ．ｏ 。 ＊通讯作者 。 ｍｉ ： ｆｇｌ ６ｃｒ ＠１ ｎ 基金项 目： 国家 自然科学基金重点 项 目（１ ７４ ５ 。 ３ ０ １ ５ ）
Ｐ ｎ ． 基因片段为探针 ， Ｄ ２ 运用 Ｎ ｒ ｅｎ杂交的方法 ｏｔ ｒ ｈ 已经发现 罗勒烯能诱导完整植物中与水杨酸和茉莉 酸 有关 防御基因的表达， 而且发现 ｆ罗勒烯能解除水 ｝ － 杨酸和荣莉酸的拮抗作用 。这表明 罗勒 是一种与 植物防御启动密切相关的信号分子。 ｆ罗勒烯 这种单萜挥发性有机物是 由萜类合成酶 ｝ ．
Ｉ ｅｎ ｉｉａ ｉ ｎ ｏ — ｄ ｔｆ ｔｏ ｆＴ— ｃ ＤＮＡ ｎ ｅｒｉ ｎ Ｈｏ ｏｚ ｇｏ ｓ Ｍ ｕ ａｎ ｎ ｓ ｆ Ｉｓ ｔｏ ｍ ｙ ｕ ｔ ｔＬｉｅ ｏｒ
Ａ ａｙ ｉｇ ｔｏ ｉ Ｒ ｙ ｔａ ｅ ｉ Ａ ａ ｉｏ ｓｓｔａｉｎ ｎ ｌｚｎ － ｃｍｅ ｅ Ｓ ｎｈ ｓ ｎ ｒ ｂｄ ｐ ｉ ｈ ｌ ａ ３ ａ
取拟 南 芥幼 叶 ２ ３片 于 １ ５ｍＬ离 心 管 中 ， ～ ． 研棒 研碎 ， ６ ℃水 浴锅 中水 浴 １ ｉ ， ２ ＴＡＢ Ｄ 至 ５ ５ｒ ｎ 加 ￣Ｃ ａ ＮＡ 提 取 液 ６ ０ｔ ０ Ｌ和 等 体 积 氯仿 ： 戊 醇 （４： ） 在 涡 Ｌ 异 ２ １，
高低 变化 。如 金鱼 草 月桂烯 合酶 、 罗勒烯 合酶 ， 拟南 芥 月 桂烯 合 酶 、 罗勒 烯 合酶 基 因 的表 达 量 和 产 物都 呈 现 午 后 高 、 间 低的昼 夜交 替规 律［，］ 夜 ｚｚ 。 ｏ１ Ａｕ ｏ ｒ ｂ ｕｇ等 （０ ２ 通 过 对 拟 南 芥 基 因 的 序 列 分 ２０ ）
用 ～ 。 引
的指示基因 Ｐ １ Ｒ 与茉莉酸信号传导途径的指示基 因
研 究发 现 ， 植物在 受到 外 界 的胁 迫 后 ， 株能 释放 植 出 ＶＯ ｓｖｌｔｅｏｇ ｎｃｃｍｐ ｕ ｄ ） ＶＯＣ Ｃ （ｏａｉ ｒａｉ ｏ ｏ ｎ ｓ ， ｌ ｓ中含有
收稿 日期 ：０ １０—３ ２ １—５２ 作者简介 ： 马泉芳 （９ １ ， ， １ ８ 一） 女 甘肃 白银人 ， 硕士研 究生 ，
长 室 中培 养 ， 境条 件 为 ： 温 ２ ～２ ℃ ， 照强 度 为 环 恒 ２ ４ 光
１ ０ ５ ￣ ｌｍ。 Ｓ １ｔ ｌｍ Ｓ ．３ ８Ｌ ｘ ，６ ２ ￣１ ０／ ／ ・ （ ｍｏ／ － ５ ． ｕ ） １ ｍｏ ｌ ￣ －
（ ｎ ｔｒｅｅ ｓｎｈ ｓ 、 倍 半 萜 合 成 酶 ｍｏｏｅｐ ｎ ｙ ｔａｅ）
物 。单 萜是 Ｃ。 萜类 化合物 ， 。 类 由两 个异 戊 二烯结 构 单
元组 成 ， 以链 状 、 环状 及 其衍 生物 的形 式 广泛存 在于 植
物挥 发油 和树脂 中［ ］ ２ 。这 类 产物 在植 物 的种群 竞争 、 矗 吸 引 昆虫传 粉 、 植食 性 昆 虫 防御 等 方 面 发挥 着 重 要 作
（ｅｑ ｉ ｒｅ ｅ ｒ ｅ ｅ ｓｓ ｕｔ ｐ ｎ ｙ ｔａ ｅ 和 ｅ ｄｔ ｐ ｎ ｅ ｓｎｈｓ ） ｙ ｔａ ｅ 。除 直链 的多 聚萜 类 （ 橡 胶 ） ， 如 外 大多 数 萜
ｈ光 照／ ８ｈ黑 暗 ， 相对 湿度 ７ ， 时浇营 养液 。待 其 ５ 定 生长 至 ２ 右 时 ， ５ｄ左 取幼 嫩 叶用于 Ｄ ＮＡ 分 离 。
析 发 现拟 南 芥 含有 ４ 个 Ｔ Ｓ类 似基 因 ， Ｏ Ｐ 并将 这 ４ Ｏ个
漩器 上 混匀 ，４００ｒｍ 离 心 ７ｍｉ； 上清 液 至一 新 １ ０ ｐ ｎ取
的 １ ５ｍＬ离 心管 中 ， ２倍 体 积 无水 乙醇 ， 时 加 上 ． 加 同 清液 １ １ ／ ０体 积 的 ３ｍｏ／ ＡＣ 轻 轻 颠 倒 混 匀 （ ｌＬ Ｎａ 一
（ ａ ｉｏ ｓ ｈ ｌ ｎ ｅｐ ｎ ｉ ｓ ｎｈ ｓ ３ 基 因 是 Ａｒｂｄ ｐ ｉ ｔ ａｉ ａｔｒ ｅ ｏｄ ｙ ｔａ ｅ０ ） ｓ ａ
Ｐ Ｒ 反应 体 系 。 Ｃ 反应体 系 为 １ Ｌ： 板 ２Ｆ ２ ５ 模 Ｌ， ×
Ｔ ｑＭａｔｒ ｘ７ ５ ａ ｓｅＭｉ ． Ｌ， 向 引物Ｆ ０ １ 正 ． Ｌ， 向引物 反
ｓ ｎ ｈ ｓ ｅ ｅ ｆｏ ｔ ｅＴＡＩ ｙ ｔ ａ ｅ ｇ ｎ ｒ ｍ ｈ Ｒ．Ｔｈ ｓ ｏ ｚ ｇ ｕ ｔ ｎ ｓｗｅ ｅｉ ｅ ｔ ｉ ｄ ｂ ｈ ｙ ｏ ｏ ｂ ｅ ｐ ｉ ｒｍｅ ｈ ｄ ｅ ｅ ｈ ｍｏ ｙ ｏ ｓｍｕ ａ ｔ ｒ ｄ ｎ ｉ ｅ ｙ ｔ ｅ ｗａ ｆｄ ｕ ｌ － ｒｍｅ ｔ ｏ ．Ｆ ｎ ｌ ｆ ｉａｌ ｙ，８ ｓ ａ ｌ ｈ ｍｏ ｙ ｏ ｓ ｅ ｅ ｉ ｍｕ ａ ｔ ｗｅ ｅ ｂ ａｎ ｄ Ｔｈ ｓ ｈ ｍｏ ｙ ｏ ｓ ｔ ｂ ｅ ｏ ｚ ｇ ｕ ｇ ｎ ｔｃ ｔｎ ｓ ｒ ｏ ｔ ｉ ｅ ． ｅ ｅ ｏ ｚ ｇ ｕ ｍｕ ａ ｔ ｌ ｙ ｏ ｄ ｏ ｎ ａ ｉｎ ｏ ｆ ｒ ｈ ｒ ｔ ｎ ｓ ａ ｇ ｏ ｆ ｕ ｄ ｔ ｆ ｒ ｕ ｔ ｅ ｏ
一
系列 小 分子 的萜 类化 合物 ［ ］现在 已经 了解 到许 多 ７。
植 物 种类 如 ： 米 、 花 、 玛 豆 、 玉 棉 利 马铃 薯 、 草 、 南 烟 拟 芥 、 茄 、 中海 松 、 叶草 、 番 地 三 月桃 叶 、 黄瓜 等 等被 节 肢
食草动物取食后， 其叶片释放 的有机挥发物中都包含 反 式一． ｆ罗勒 烯 ［ 。 已有 研 究结 果表 明 ， 式． ． ｝ ７ 。 叫。 反 ｆ 罗勒 ｝
ＭＡ Ｑｕ ｎ ｆ ｎ ａ — ｇ，Ｗ ＥＩ ａ ，Ｌ Ｕ Ｃｈ ｎ ｌ ａ ｎ Ｉ ｕ －ｉ Ｒ ｎ （ ｇ ｉ ｌ ｒｌ ｏｌ ｅｏ ｕ ａ ｇ ｉｕｔ ｒ ｌ ｉｅｓｔ ， ｈ ｎ ｓ ａ Ｈｕ ａ １ １ ８ Ｃ ｉａ Ａ ｒ ｕ ｔ ａ Ｃ ｌ ｇ ｆ ｎ ｎ Ａ ｒ ｌ ａ ｖ ｒｉ Ｃ ａ ｇ ｈ ， ｎ ｎ ４ ０ ２ ， ｈ ｎ ） ｃ ｕ ｅ Ｈ ｃ ｕ Ｕｎ ｙ
作用机理 。 需要获得 罗勒烯合成酶 基因表达 沉默 的实验材料 。 根据ＴＡ Ｒ 网站 上公布的 罗勒烯 合成酶信 息， Ｉ 从美 国拟南
芥生物资源 中心购买该基因的 Ｔ ＤＮＡ插入突变体材料 ， — 运用双引物法对这些 突变 体进｛． — ＮＡ插入位点的鉴定 ， －了Ｔ Ｄ 获得
８株稳定遗传的纯合 突变体 ， 该结果为深入研究 罗勒烯 的功能 奠定了 良好基 础 。 关键词 ：Ｂ罗勒烯 ； ＿ 单萜合酶 Ａｔ Ｐ ０ ； — ＮＡ插入突变 ； Ｔ Ｓ ３Ｔ Ｄ 拟南芥 中图分类号 ： ８ Ｑ７ 文献标识码 ： Ａ Ｄ ：１． ９ ９ ｊ ｓｎ １ ０ —２ ０ ２ １ ． ５ １ Ｏｌ ０ ３ ６ ／ ｉ ．０ １５８ ． ０ １０ ． ３ ．ｓ 文章 编号 ：１０ —２ ０ ２ １ ）５０ ７—５ ０ １５８ （０ １ ０ —４ ７０
（ ｒｅｉ ｙ ｔａｅＴ Ｓ 催化合成的。萜类合酶类 ， ｔ ｐ ｎ ｄｓ ｎｈｓ ， Ｐ ） ｅ ｏ
４８ ７
ＣＲＯＰ ＲＥ Ｅ Ｓ ＡＲＣＨ
以 氨 基 酸 序 列 相似 度 ４ 为基 准 将 其 分 为 ＴＰ —～ Ｏ， ９ ６ Ｓａ
Ｔ Ｓ ｇ ７个 亚 家 族［ ，］ 它 主 要 包 括 单 萜 合 成 酶 Ｐ — １１ ， ８９
ｉｖ ｓｉａｉｇｔｅｆｎ ｔ ｎｏ ￣ｏ ｉ ｎ ． ｎ ｅｔ ｔ ｈ ｕ ｃｉ ｆ ｃ ｇ ｎ ｏ ｍｅ ｅ Ｋ ｙｗｏｄ ： －ｃｍ ｎ Ｍｏ ｏｅｐｎ ｙ ｔａｅＡｔ Ｐ ０ ； Ｄ ｓｒｉｎｍｕａ ｔ Ａｒｂｄ ｐｉ ｔａｉｎ ｅ ｒｓ ￣ｏｉ ｅ ｅ ｎ ｔｒｅ ｅｓ ｎｈ ｓ Ｔ Ｓ ３ Ｔ— ＮＡ ｉ ｅｔ ｔｎ ； ａ ｉｏ ｓ ｌ ａ Ｉ ｎ ｏ ｓｈ ａ